1)用EcoRI和HindIII在100μL中消化20μg适当的pUC重组质粒DNA，释放出含有2〜10个蛋白质结合位点的插入片段。

2)在限制酶切反应中加入下列成分：

1mol/LTris•Cl,pH7.5,终浓度50mmol/L、dCTP、dGTP、dTTP各5mmol/L,终浓度100μLmol/L、200μCi[α32P]dATP(5000Ci/mmol)、10UKlenow酶

室温下温育30min。加入5mmol/LdATP至100μmol/L继续温育30min。

3)加EDTA至20mmol/L以中止反应。依次用25:24:1的酚/氯仿/异戊醇及24:1的氯仿/异戊醇抽提DNA。加乙酸钠至0.3mol/L,用100%乙醇沉淀DNA。

4)重悬于200μL水中，加22μL3mol/L乙酸钠，pH5.2，再用100%的乙醇沉淀。

5)用0.75mm厚、5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶分离标记的DNA片段。

6)用放射自显影使标记的DNA片段显迹。将含有结合位点片段的凝胶条切出，浸泡于1.5mL洗脱缓冲液中于4℃振摇过夜。

7)用移液器转移上清，用Elutip-d层析柱从上清中纯化标记的探针。用闪烁计数(cpm)确定³²P标记的DNA结合位点探针的活性，并在4℃保存。

上述反应条件可产生具有2〜4×10⁷cpm/pmol比活性的DNA探针。足以用于筛选20张呈现约10⁶个噬斑的滤膜。

8)37℃在LB/麦芽糖/氨苄青霉素培养液中培养大肠杆菌Y1090至生长饱和（通常过夜)。

9)每涂布一块平板，在一个试管中将0.5mLY1090过夜培养物与λgtll文库（含有3×10⁴〜5×10⁴pfu)混合。

10)在37℃温育15min使噬菌体吸附到细胞上。

11)加9mL顶层琼脂糖于每个试管中，颠倒混合几次，铺于含有LB/氨苄青霉素的150mm平皿上。

12)将平皿置于42℃温育约3h直至可见细小噬斑。

13)将平皿移至37℃温箱，不要让平皿降至37℃以下。

14)准备用于覆盖的硝酸纤维素膜（用平头镊子操作），将膜在10mmol/L的IPTG溶液中浸30min,在室温下空气中干燥60min。

15)用经IPTG浸润并晾干的硝酸纤维素膜覆盖于每个平皿上，37℃继续温育6h。

16)将平皿置于4℃冷却10min。用针扎孔标记每张膜的位置。揭下膜浸于BLOTTO中。室温下孵育60min，并轻轻旋动。用Parafilm膜封好主平皿，保存于4℃。"

17)将所有的膜都浸于盛有结合缓冲液中（500mL/10张膜）的碟子中，在室温下振荡温育5min用新鲜的结合缓冲液重复洗涤2次（在筛选前滤膜可在4℃保存24h)。

18)将超声处理的小牛胸腺DNA在100℃加热10min变性，然后放在冰上速冷。加入结合缓冲液至浓度为5μg/mL(最终体积为25mL/10张滤膜）。在此溶液中加入³²P标记的DNA结合位点探针（来自步骤7)至1×1O⁶〜2×10⁶cpm/mL,约10-10mol/L将滤膜一块块地放到探针溶液中，室温下轻轻振荡60min。

19)分批洗膜，室温下每10张膜用500mL结合缓冲液洗4次（每次洗7.5min,共30min)

20)吸干滤膜，用塑料膜包裹，用增感屏在-70℃对×射线胶片曝光12〜24h。

21)将噬菌体平皿与放射自显影片对比，分离与阳性信号对应的琼脂糖块，并再生噬菌体液。

真正的阳性信号呈光晕状。可做多张不同曝光时间的自显影片以排除那些不能重复的信号点。

22)用0.2mLY1090菌培养物和3mL顶层琼脂糖对再生的噬菌体液（约5000pfu/100mm平皿）铺板，参见步骤8〜11。

23)用82mm滤膜制备硝酸纤维素膜复印品并进行二次筛选，见步骤12〜20。

24)按照步骤1〜7标记缺少识别位点（或含有突变的识别位点）的pVC重组质粒DNA,用本实验标记的探针来二次筛选真正阳性的噬菌体液。

25)纯化噬斑，将阳性噬菌体覆盖上1滴氯仿，置于4℃保存。