耐药质粒DNA转化实验 本实验学习将质粒DNA分子转入大肠杆菌的方法及如何筛选带有质粒DNA的细胞克隆,即转化子。 【原理】 受体菌EcoliRRI在低温条件下经Ca++处理,可改变细胞膜的通透性,利于受体菌对DNA的摄取,这种经Ca++处理的细菌称感受态菌。pBR322质粒带有氨基苄青霉素(Ap)和四环素(Tc)基因,如将pBR322质粒转入到对上述抗生素敏感的EcoliRRI菌体内,则可使该细菌获得Apr和Tcr,表现出对Ap和Tc的抗药性。 (一)感受态菌的制备 【材料】 1.菌株E.coliRRI 2.LB液体培养基 3.75mMCacl2 4.其它:灭菌小试管、刻度吸管、微量加样器、离心机 【方法】 1.将细菌接种于5mlLB液体培养基中,37℃振荡培养16~20h。 2.取新鲜菌液,按1/100的接种量接种于LB培养基中,37℃振荡培养2~3h。 3.取1.5ml菌液,4℃3000rpm/min,离心5min,弃上清。 4.菌体沉淀加入750μl预冷的(4℃)75mmol/LCaCL2溶液,轻轻吹打菌悬液,放冰浴30min。 5.4℃3000rpm/min,离心5min,弃上清。 6.菌体沉淀加入200微升预冷的75mmol/LCaCL2溶液,冰浴4min以上。4℃保存备用。 (二)质粒转化 【材料】 1.pBR322质粒DNA, 2.感受态菌75mmolCaCl2 3.LB肉汤培养基,无药LB琼脂平板,氨苄青霉素琼脂平板(50ug/ml) 4.其它:灭菌小试管,L形玻璃棒 【方法】 1.取2个洁净,灭菌的EP管,按表10-2加入各成分: 2.上述2个试管充分混均匀后,置冰浴30min。3.42℃2min或37℃5min,立即置冰浴2min。4.加入1mlLB肉汤培养基,37℃静止培养1h。 (三)转化子筛选: 1.取实验组培养菌液涂布在氨苄青霉素琼脂平板(50ug/ml)上,对照组菌液分别涂布在无药LB琼脂平板和氨苄青霉素琼脂平板上,每块板涂0.1ml,用灭菌L形玻璃棒涂匀。将涂好的平板置370C培养过夜,观察转化结果。 2.E.coli受体菌不含有质粒DNA,也不含Apr和Tcr。在含Ap和Tc的培养基中不能生长,若实验组在含Ap和Tc的平板上出现菌落,可初步确定受体菌获得了耐药性质粒,然后再通过提取质粒DNA进一步鉴定转化子。