Lymphocyte surface molecules The tetraspanin superfamily...
| 试剂、试剂盒 | 蒸馏水乙醇甲酰胺胶的缓冲液亚甲基蓝十二烷基硫酸钠储存液TAE缓冲液Tris乙酸盐乙酸纳EDTA蓝色葡聚糖TEN缓冲液40mer聚丙烯酰胺胶 仪器、耗材 | 解剖刀UV灯过滤UV的安全破璃 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液、溶液和试剂 蒸馏水 乙醇，95% 甲酰胺(使用安珀莱特单床离子交换树脂MB-1除去离子，并储存在暗中） 胶的缓冲液是标准的TBE+6mol/L尿素 亚甲基蓝，100X，0.05% 十二烷基硫酸钠储存液，10% TAE缓冲液 40mmol/LTris乙酸盐 20mmol/L乙酸纳 0.2mmol/LEDTA,pH8.3 蓝色葡聚糖，1mg/ml TEN缓冲液 10mmol/LTris-HCl,pH7.9 10mmol/LNaCl 0.1mmol/LEDTA 2.核酸和寡核苷酸 40mer(40bp寡核苷酸） 3.凝胶 聚丙烯酰胺胶，其中丙烯酰胺：双丙烯酰胺的比值为100:1(总共12%丙烯酰胺），胶的大小为40cmX20cmX2mm 4.特殊设备 解剖刀 UV灯(UVGL-58,Ultraviolet产品） 过滤UV的安全破璃 二、方法 1.将每种40mer以1mmol/L的终浓度悬浮在TEN缓冲液中，每个泳道（1cm宽）仅上样1000pmol(1ul+4ul甲酰胺）。 2.当40mer迁移了约30~35cm时，将胶浸泡在蒸馏水中并更换两次水，以除去尿素，然后用0.0005%的亚甲基蓝染色过夜。可见的蓝色条带并非准确地同步迁移，这是由于序列效应的影响，尽管它们全都是40bP的寡核苷酸。另一种可以选择代替染色的方法是用紫外投影的方法来检测凝胶中的条带，戴上护目镜，用手持的UV光源从上方照射放于普通打印纸上的胶，肢中条带的荧光要弱于周围的荧光。 3.用新解剖刀切下每一种的最主要的条带，在3倍体积的0.1%的SDS和TAE中37°C浸泡1或2个晚上。回收上清液（避免胶的破碎），用3倍体积的乙醇沉淀。 4.将经重新电泳、亚甲基蓝染色后的40mer与一些加入的未经纯化的40mer相比较，估计出40mer的产量，将其作为所有寡核苷酸的代表数据。在实验中，整个的产率约为30%,这一数据被采用来针对所有的寡核苷酸。 5.将寡核苷酸汇集，并将每一种的浓度在TEN缓冲液中调整到  |
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发布于 ： 2021-08-22
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