Taq DNA Ligase catalyzes the formation of a phosphodiester bond in duplex DNA containing adjacent 5′-phosphoryl and 3′-hydroxyl termini, using NAD+ as a cofactor.
Source of ProteinA recombinant E. coli strain carrying the cloned Taq DNA Ligase gene.
Supplied in10 mM Tris-HCl50 mM KCl1 mM DTT0.1 mM EDTA0.1% Tween-2050% glycerolpH 7.5 @ 25°C
Supplied With B6060 (10X Taq DNA Ligase Buffer)
10X Taq DNA Ligase Buffer (B6060)200 mM Tris-HCI250 mM KCl100 mM MgCl25 mM NAD0.1% Triton X-100pH 7.6 @ 25°C
Unit Definition1 unit is defined as the amount of Taq DNA Ligase required to join 50% of 1 µg of the 12-base cohesive ends of Lambda DNA cut with Sma I and Sal I in 50 µl 1X Taq DNA Ligase Buffer following a 10 minute incubation at 45°C.
Enzymatics专注于于酶产品的研发,为市场带来了特殊的、高品质的产品。是一家试剂、试剂盒和测定的领先生产商,使全球客户变革了诊断、治疗和生命科学的研究。业务包括:试剂、供应链解决方案,应用科学,其测序产品市场占有率达80%。
酶科技公司产品包括八类:超纯连接酶如T4连接酶、超纯poly酶、ArcherTM系列测序工具(ArcherProducts)、连接蛋白、DNA修饰酶、NGS文库制备(NGSLibraryConstruction)、核酸和RNA酶。
Enzymatics专注于于酶产品的研发,为市场带来了特殊的、高品质的产品。是一家试剂、试剂盒和测定的领先生产商,使全球客户变革了诊断、治疗和生命科学的研究。业务包括:试剂、供应链解决方案,应用科学。目前市场上80%测序产品来自Enzymatics(“Todayourproductsunderpinover80%ofthesequencingreactionsthatarerunaroundtheglobe”)。Enzymatics产品的好处之一--能提高效率:NatureMethods中提到“使用Enzymatics超纯连接酶,连接步骤的效率得以提高,连接片段的产量增加了20-30%”。好处之二--有效降低测序成本:遗传学界的泰斗GeorgeChurch更是认为Enzymatics是"apowerfulcatalystinthedemocratizationofsequencing"。合作伙伴包括:BGI,BerryGenomics,Illumina,454LifeSciences和IonTorrentSyst,皆对Enzymatics的出品赞不绝口。
Enzymatics--核酸25mM100µmoldNTPSolutionMix--N2050L,N2050F
核酸25mM100µmoldNTPSolutionMix
摘要:四种天然脱氧核苷酸的等摩尔混合溶液(25mM)
产品描述
Anequimolar(25mM)mixtureofthefournaturaldeoxynucleotides.
四种天然脱氧核苷酸的等摩尔混合溶液(25mM)
SuppliedAs:25mMeachdNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)atpH7.5
产品信息
PartNumberN2050L,N2050F
Concentration25mM
UnitSize100µmol,20µmol
产品特性
StorageTemperature-25to-15°C
Purity≥99%
BasePurity≥99.5%
Pyrophosphate≤0.003pmol/pmolofnucleotide
EnzScript™(MMLV逆转录酶,RNaseH-)
摘要:基于RNA的DNA聚合酶,无核酸内切酶活性
产品描述:
EnzScript™(M-MLV逆转录酶RNaseHminus)属于RNA依赖的DNA聚合酶,该酶无RNaseH活性。EnzScript™被用于从polyAmRNA或总RNA中产生首链CDNA以用于下游的一些用途,如RT-PCR,cDNA克隆或RNA-Seq的文库构建。RNaseH结构域中的点突变能增加酶的热稳定性,相比于野生型M-MLV逆转录酶,它支持全长转录物种产生更高的cDNA产量
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2.SNaPshot 该技术由美应用物公司(ABI)发基于荧光标记单碱基延伸原理型技术称测序主要针等通量SNP型项目含测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临态位点5’-端同度延伸引物PCR产物模板反应体系引物延伸碱基即终止经ABI测序仪检测根据峰移位置确定该延伸产物应SNP位点根据峰颜色知掺入碱基种类确定该本基型于PCR产物模板通重PCR反应体系获通用于10-30SNP位点析
用takara的in-fusion方法做了个重组质粒,如左图PCR验证,右起第二道是空载质粒为模板的对照。右图是酶切验证,两个图片结合起来觉得除了第四个单克隆外,其他几个应该都可能是阳性克隆。结果送了1,2两个样品后测序的结果都不对。为什么会这样。
2.SNaPshot法 该技术由美国应用生物公司(ABI)开发,是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术,也称小测序,主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’-端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中,引物延伸一个碱基即终止,经ABI测序仪检测后,根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点,根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类,从而确定该样本的基因型。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。通常用于10-30个SNP位点分析。
期待着高手们的指点,谢谢。
两个基因大小分别230kb和450kb,酶切后,450kb的有目的条带,但很弱,230kb的质粒条带亮,其下方有一很微弱条带,用的酶分别是:Ncol和Spel体系是(Takara,两个酶切体系不同,用的官网推荐体系):
NcoI1μl
Spel1μl
10×KBuffer2μl
0.1%BSA2μl
DNA3ul
灭菌水upto20μl37℃4h电泳1h
以这些标准看,目前的基因组测序结果,还没有一个是完美的。
人类基因组:缺点在哪里?
首先,人类基因组还不够精确。人是“二倍体”,也就是有一半遗传物质来自父亲,一半遗传物质来自母亲,且在受精卵形成过程中,还会发生基因重组,这是人类遗传多样性的来源之一。科学家们需要更精确的“单倍型”数据,这样基因组才够“完美”,而这种“完美”正是研究者们追求的目标。
其次,人类基因组还不够多元。
按照传统的人种分类,人类按照肤色黑白黄棕,被粗分为四大类:尼格罗人种、高加索人种、蒙古人种、澳大利亚人种。基因组测序数据是从高加索人种开始的,人类基因组计划是人类的标准参考基因组,也是高加索人种的标准参考基因组。文特尔的基因组,测序对象是他自己,同样是高加索人种。
然而,从基因组研究的角度,为了尽可能地包括各种遗传背景,需要为更多族裔建立自己的参考基因组。
资料来源:http://www.mv163.cn/jkgl/news/2015/1224/5227.html
【之前构建的4个重组质粒里也有两个出现这样的问题(aagtcc变成agtcc),但是酶切能切出插入的片段】
目前问测序公司得到的答复是样品可能不是单克隆,测序结果是不准确的,建议重新挑取单克隆测序。
不知道还有没有别的方法?
目的片段用kpn1和xho1双酶切,然后连接到PGL4.10上,结果用RPV3测序出来目的序列是反向互补的,这是什么原因导致的?