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| 선택 | Cat.No. | 제품명 | 가격(VAT별도) | 수량 |
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제품특징
□ 제품설명
MightyAmp DNA Polymerase는, 특히 2 kb 정도까지의 짧은 사슬의 증폭에 있어서 최적의 반응성을 추구하여 개발된 PCR 효소이며, 일반적인 PCR 효소에서는 증폭이 곤란한 PCR저해 물질을 많이 함유하고 있는 crude한 생체 추출액을 이용할 경우에도, 강력한 증폭 능력으로 인한 양호한 반응성을 보인다.본 제품은 MightyAmp DNA Polymerase와 전용 버퍼를 조합하여, 혈액, 구강점막, 식물의 잎 등의 시료를 도포한 FTA 카드나 혈액을 채집한 여과지로부터, DNA 추출, 정제 등의 조작을 할 필요 없이, 직접 원하는 DNA서열을 PCR증폭할 수 있다. 통상, 시료를 도포한 FTA카드로부터 PCR증폭을 하기 위해서는 여러 과정의 DNA 정제 조작이 필요하지만, MightyAmp for Card를 이용하는 것으로, DNA정제 조작 없이 단시간에 다 검체의 해석이 가능하다.한편, 본 효소는 98 ℃까지 polymerase활성을 억제하는 강력한 monoclonal 항체를 이용한 hot start PCR용 효소다.※ FTA 카드는 GE Healthcare 제품입니다.
□ 내용
| 200 회용*1 | |
| MightyAmp DNA Polymerase (1.25 U/㎕) | 200 ㎕ |
| 2×MightyAmp Buffer for Card (Mg2 +, dNTP plus )* 2 | 1 ㎖ x 5 |
* 1 반응용량 50 ㎕의 수 * 2 Mg2+ 농도는 4 mM (2× ), dNTP 농도는 800 ㎛each (2 × ) |
□ 보존 -20℃
□ 일반적인 PCR 반응액 조성 (Total 50 ㎕)
사용량 | 최종 농도 | |
|---|---|---|
| 2 × MightyAmp Buffer for Card | 25 ㎕ | 1 × |
| Primer 1 | 15 pmol | 0.3 ㎛ |
| Primer 2 | 15 pmol | 0.3 ㎛ |
| 시료를 도포한 FTA Card / 여과지* 1 | 직경 1.2 ~ 2 mm | |
| MightyAmp DNA Polymerase | 1 ㎕ | 1.25 U/50 ㎕ |
| dH2O | up to 50 ㎕ |
*1 시료 예- EDTA 처리 혈액, Heparin 처리 혈액을 도포한 FTA Gene card, FAT Micro Card 또는 여과지- p식물잎을 파쇄하여 도포한 FTA Plant Saver Card- 구강 세포를 도포한 FTA Micro Card- 식물잎을 직접 도포한 FTA Plant ard * 2 구연산 혈액을 사용하면 반응이 크게 저하되므로 구연산 혈액을 이용한 샘플의 사용은 권장하지 않는다
□ Primer 디자인에 관하여
가능한 OLIGO Primer Analysis Software ( Molecular Biology Insights 사) 등 primer 디자인 소프트웨어를 이용 하여 최적의 배열을 선택합니다. Tm 값 (아래 식*기준)이 60 ℃ 이상이 되도록 설계할 것을 권장한다. * Tm 값 ( ℃) = [ (nA + nT ) × 2 + ( nC + nG ) × 4] -5MightyAmp DNA Polymerase의 경우 inosine 을 함유하고 있는 primer의 사용은 피한다
□ PCR 조건
신장(extension) 온도를 68℃로 설정한 3 step PCR 표준 조건이다.[3 step PCR ]
| 98 ℃ | 2 min. * 1 | |
| ↓ | ||
| 98 ℃ | 10 sec. | ┐ |
| 60 ℃ | 15 sec. | │ 30~40 cycles |
| 68 ℃* 2 | 1 min. / kb | ┘ |
또는
| 98 ℃ | 2 min. * 1 | |
| ↓ | ||
| 98 ℃ | 10 sec. | ］30~40 cycles |
| 68 ℃ | 1 min. / kb |
* 1 강력한 hot start 항체를 사용하고 있기 때문에 반드시 98 ℃, 2 분 초기 변성을 실시하여 항체를 열 변성 시킨다.* 2 3 step PCR 의 경우 신장 온도를 68 ℃로 설정 한다.
□ 전기영동
MightyAmp DNA Polymerase를 이용하여 증폭한 PCR 산물을 전기 영동 할 경우 TAE Buffer의 사용을 권장한다. TBE Buffer를 사용하면 이동 패턴이 다소 퍼지는 현상이 발생하여 깨끗한 영동 결과를 얻지 못할 수 있다.
□ PCR 산물에 대해
MightyAmp for FFPE를 사용하여 증폭한 PCR 산물의 대부분은 3" 말단에 A가 1 염기 추가되어 있다. 따라서 PCR 산물을 그대로
T - Vector ( pMD20 : TaKaRa code 3270, pMD19 (Simple ) TaKaRa Code 3271 )에 클로닝 할 수 있다.
□문제해결
현상 | 문제점 | 대책 |
증폭되지 않거나증폭 효율이 좋지 않다. | primer의 Tm 값 | 위의 추천 계산식을 이용하여 primer를 디자인한다 |
2 step PCR | 3 step PCR 을 시도해 본다. | |
3 step PCR | 2 step PCR 을 시도해 본다 | |
(3 step PCR 증폭 하지 않는 경우 2 step 으로 증폭하는 경우가 있습니다 ) | ||
Annealing | 2 ℃ 씩 내려 본다 | |
Cycle 수 | 사이클 수를 최대40cycles 까지 증가 시켜 본다 | |
시료 크기 | 직경 2 mm 로증폭 되지 않는 경우 → 직경 1.2 mm 하기 | |
직경 1.2 mm로증폭 되지 않는 경우 → 직경 2 mm 하기 | ||
비 특이적 증폭이현저하다. | primer의 Tm 값 | 위의 추천 계산식을 이용하여 primer를 디자인 한다. |
3 step PCR | 2 step PCR 을 시도해 본다 | |
Cycle 수 | 25 ~ 30 cycles 설정 |
ebiomall.com
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新手一枚，看到论坛里也有许多人问过，但没找到比较确切的回答，还是不是很理解，做芯片给出的lncRNA的名字是XLOC_009167，这个名字在ncbi里面都找不出来，我该怎么样去获得这个rna的信息呢？
我们在设计pcr引物的时候，经常需要将设计好的正反向引物与基因组DNA序列进行比对验证，但是因为反向引物是反向互补的，所以有些麻烦。因此，在这里介绍两个非常的小工具，一个是在线的模拟PCR，一个是本地运行的程序包，我会以附件形式上传，不需要蚁豆即可下载。两个都写得非常详细，相信大家都能看懂。不知道这个帖子能不能加分？希望版主看到后给予加分奖励
方法一：UCSC中的In-SilicoPCR
1、登录UCSC，网址链接http://www.genome.ucsc.edu/index.html，点击右侧工具的In-SilicoPCR，或者在Tools下拉框中点击In-SilicoPCR，如下所示：
2、点击In-SilicoPCR后，出现如下界面，我们需要将自己设计好的正向引物和反向引物分别粘贴至各自空白框，点击submit。对其它几个参数做点说明吧，MaxProductSize是指被放大区域的最大长度，MinPerfectMatch是指和引物的3‘末端PerfectMatch的最小碱基数目，MinGoodMatch:是指和引物的3‘末端GoodMatch的最小碱基数目，GoodMatch是3个碱基里最少匹配2个，FlipReversePrimer:反向引物反向互补。
3、我用自己设计的基因举例说明：HNF-1α的EXON2，参考序列：NM_000545，正向引物5’-3‘：CAGCCCTTGCTGAGCAGATCC，反向引物5’-3‘：CCACTGACTTCCTTTCCATCTACC。正向引物和反向引物分别粘贴至各自空白框，点击submit。出现如下结果，其中第一个红色标记指染色体位置，第二个红色标记指长度，第三个红色标记是我们输入的正反向引物，第四个标记可以直接链接至Primer3在线设计引物，网址http://primer3.ut.ee/。比对染色体位置就可以知道我们设计的引物是否包括HNF-1α的EXON2。
方法二：Reverse程序
这个程序是一位程序员朋友专门为我们编写的，操作非常简单，输入反向互补的引物序列后，就可以得到原始碱基序列。文件夹内一共才3个文件。
举例说明，HNF-1α的EXON2，参考序列：NM_000545，正向引物5’-3‘：CAGCCCTTGCTGAGCAGATCC，反向引物5’-3‘：CCACTGACTTCCTTTCCATCTACC。
1、点击target，粘贴反向引物序列。
2、点击右上角关闭键，这时候会弹出对话框，点击保存。
3、打开文件夹中的reverse_complement应用程度，按任意键即可自动关闭。
4、打开文件夹中的result，就可以得到反向互补引物序列对应的原始序列。
5、这时候就可以将正向序列和刚刚得到的原始序列一起代入HNF-1α的EXON2中检验我们设计的引物是否覆盖了目标片段。
好了，就这两个小工具了，非常实用，希望大家有所收获。有什么疑问可以给我留言或者私信我，支持我的战友就请给我投票吧。版主能给予我加分奖励吗？
reverse_complement.rar(95.82k)
非要说差别，可能就在测序引物是让片段线性增加，PCR引物是让片段指数增加。
引物是一小段单链DNA或RNA，引物可以做为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点，在细胞外的条件下，只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。
引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。
启动子和引物两者的区别：
启动子是DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点，决定RNA聚合酶转录起始位点的DNA序列。引物是一小段单链DNA或RNA，引物可以做为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点，在细胞外的条件下，只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。
启动子是位于结构基因前的非编码区对转录起调控作用的一段DNA序列。引物则是游离于DNA复制的模板链之外的对DNA复制起调控作用的一小段单链DNA或RNA。
