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METHOD 1:Formaldehyde preservative – 2% formaldehyde solution in protein-free phosphate-buffered saline (PBS).Prepare as follows:Add 2 g paraformaldehyde powde 查看更多>
1. Obtain the last 2mm of tail and place directly into 200ul 1X PCR Bufferwith Nonionic Detergents (PBND) in a 1.5ml microfuge tube. (Tails can bestored at fro 查看更多>
Dye Filling to Stain Amphid and Phasmid Neurons by Michael Koelle, from Beth Sawin 4/6/94 1. Buy DiO from Molecular Probes, catalog # D-275. DiO fluorescesces 查看更多>
Exalpha Biologicals produces and sells products for Life Science Research, including monoclonal and polyclonal antibodies, for use in immunohistochemistry, wes 查看更多>
LacZ-cell Staining Materials: 1) 0.5% glutaraldehyde in PBS 2) 20mM K4Fe(CN)6o3H2O 0.44g into 50 ml PBS 3) 20mM K3Fe(CN)6 0.33g into 50 ml PBS 4) X-gal 2% in D 查看更多>
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1. 注意事项:1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态,约为80 – 90 %致密度。1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。不宜将冻存细胞放置在0℃~-60℃这一温度范围内过久,低温损伤主要发生在这一温 查看更多>
Double dye filling (using DiO and di-4 ANEPPS)(Krista Williams) Dye Filling Label 15 ml centrifuge (c/f) tubes with strain name. Squirt ~1-2 ml M9 onto plate w 查看更多>
Vital Staining of Chromosomes with Hoechst 332581. Hoechst 33258, 10 mg/ml stock in DMSO. 2. Culture medium. 3. 15 ml sterile conical tube. 1. In a 15 ml conic 查看更多>
Steve HahnLast Modified December 1997This method works well when transforming with a plasmid and is rapid. (for highest efficiency transformation, see DMSO tra 查看更多>
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我是定量PCR的新手,有很多问题要请教大家。
我做的病毒的普通PCR结果还可以。我现在要做该病毒的定量。用的是ICycler定量PCR仪器。有那位高手能告诉我怎样操作该仪器。
我还要重新设计目的基因片段的因物吗?如果不用重新设计,那我下一步应该为做定量PCR做哪些准备呐?还需要设计参照模板吗?
这种实验的把握性有多大?
大家有什么更好的建议吗?
各位好!
附件中是我的标准曲线结果,标准品按照10x稀释,荧光染料是SYBR,可是在荧光强度与CT值的关系图中,曲线间的行距还可以接受,但是在LOG荧光值与CT值的关系曲线中,曲线怎么那么难看呢?为什么他们之间的行距不是相等的呢?我以前做的曲线很漂亮的,这是什么原因呢?影响定量的结果吗?并且在样品中也出现这么难看的曲线,就是指数增长期曲线不平滑,是什么原因呢?

切盼高手指点!!!

standardcurve.doc(49.0k)
还可以标记细胞内的某些蛋白吧
各位同盟,有谁在做甲基化的荧光定量PCR吗?小女子有诸多问题求救~~~~

甲基化的荧光定量pcr的标准品是不是用完全甲基化的DNA和完全非甲基化的DNA,具体应该怎么操作啊?

我打算用sybrgreen作为荧光染料

用相对荧光定量还是用绝对荧光定量呢.......恳请各位指教!
因外用杀精避孕药机理研究的需要,求助目前较新的有关精子流式细胞检测的实验资料,请各位大侠不吝赐教!
带荧光的染料含不含重金属
碘化丙啶(propiolium iodide,PI)能嵌入DNA双螺旋中,可使荧光强度增加约20倍,以488nm波长激发,DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm。小鼠Lewis肺癌细胞DNA含量测定方法(1).从C57BL/6小鼠上切除肿块,在培养皿内用PBS冲洗。(2).去除结缔组织及,剪碎肿块。(3).小碎片移入1.20×38mm针,加压使其通过,于4℃条件下重悬细胞于HBSS中。(4).将200~300μL细胞悬液(5×105细胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL),染色3LL细胞,于4℃存放20~30分钟。(5).测定580~750nm之间的发射荧光,以去除末结合PI产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。注:PI染色液:0.1%柠檬酸钠1000mL+PI 5mg + 1% Nonide P40水。2. 培养细胞DNA的流式细胞仪分析(1).从培养皿中吸去培养基,以HBSS冲洗二次。(2).加入PI5mL于培养皿中,在4℃放10分钟。(3).用吸管反复次打细胞,使细胞破坏,胞核释放出来,再行流式细胞仪分析。3. 完整细胞DNA的PI染色(1).70%乙醇固定的细胞悬液,离心,去固定液。(2).室温条件下加入PI染色一批细胞(105~106细胞/mL),时间为30分钟,然后行流式细胞仪分析。(二)吖啶橙染色1. DNA和RNA的鉴别染色利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定,非固定细胞核酸,或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果,但该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下:1)试剂:(1)溶液A:低温保存,稳定期约2周。Triton X-100(0.1%) 0.1mL,1mol/L HCL 8mL1mol/L NaCL 15ml蒸馏水76mL,P
我是一个新手。做了两次real-timePCR(SYBRGREENI)标准曲线都很差劲,请好心的大侠们帮忙指点迷津。

标准品是用质粒DNA做了。第一个图是按10倍梯度进行稀释,以10^3~10^9copy/μl7个浓度的标准模板系列作为标准品;第二个图是按10倍梯度进行稀释,以50~0.0005ng/ul6个浓度的标准模板系列作为标准品,得到的标准曲线的参数值分别是R^2=0.87998694<0.99,Slope=-1.403786(图一);R^2=0.9702126<0.99,slope=-1.5033078.

我应该从哪些方面来改进我的实验?紧急求助!
背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间,定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度,信号收集的温度为60°C。随后,SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值,提取结果并保存到校正文件中。软件在今后的分析中将自动调用此校正文件,从实验数据中扣除背景信号。
  什么是纯荧光校正,多长时间校正一次:
  纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度,通俗地说是让仪器“认识”各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。以后每次定量实验运行过程中,SDS软件收集样品的原始光谱信号,并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较,精确扣除不同染料的信号重叠部分,从而确定样品中的荧光染料种类和信号强度。
  推荐每半年进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前,请先进行背景校正和ROI校正。
荧光染料按照化学架构分属于什么染料
这些染料的结构式基本是保密的。有些地方能查到,象维基上就有SYBR Green的结果式,但谁也不能肯定是否是正确的。
这个么…染色一般用新亚甲蓝枸橼酸钠,全血涂片可用瑞氏染液或新亚甲枸橼酸钠,
最近在看文献时,看到realtime-PCR做相对定量的时候,要求目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。我现在要做一些基因的相对定量,所以有几个问题想问问主任和各位高手。
1.怎么看两个反应-即目标基因和内参基因是否具有相同的扩增效率?
2.每次PCR反应的扩增情况都有差异,多次反应的扩增效率岂不是都不一样了吗?
3.如何设计才能让相对定量更可行?
由于对定量PCR的接触不多,希望各位高手多多帮助!谢谢!
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