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제품특징
□ 특징
● SMART-Seq® v4 기반으로 single-cell 또는 10pg의 극소량 total RNA 적용
● 전사체의 3’ 말단만 특이적으로 분석하여 합리적인 가격으로 High-throughputDifferential Expression (DE) 분석 가능
● 최대 12 Multiplexing Illumina® Library 제작 가능
□ 최상의 결과를 보장하는 SMART 기술
단일세포 (Single cell) 전사체 분석은 ‘세포집단 (cell population) 내에서 각각의 세포의 어떤유전자 발현율을 보이는지’ 를 이해하는 데 중요하다.SMART-Seq® v4 3’ DE Kit는 단일세포 유래의 mRNA의 3’ 말단의 서열 정보를 얻을 수 있어 유전자 발현차이 분석(Differential gene Expression (DE) analysis)에 최적이다. 본제품은 SMART®법과 Locked Nucleic Acid (LNA)기술을 응용한 SMART-Seq® v4 키트의 특징을 도입하였다. mRNA의 3’ 말단만 집중적으로 서열을 분석 가능하며, 본 제품 내 Read2의 바코드로 인식, 사용할 수 있는 In-line 인덱스가 포함되기 때문에 샘플까지 Multiplexing NGSLibrary를 제작 및 분석이 가능하다. 1 ~ 10.5ul의 RNA volume을 적용 가능하며 제작된 cDNA는 Illumina Nextera® XT DNA Library Preparation Kit*1를 이용하여 NGS Library 제작*2이 가능하다. 본 제품을사용하여 제작된 NGS Library는 Illumina® HiSeq®,NextSeq®*3,MiSeq®, and MiniSeq™*3에적용할 수 있다. *1: Fragmentation과 Tagging 과정을위해 Nextera® XT DNA Library Preparation Kit가 별도 필요 *2: Library index는 이론적으로 최대1,152 (=12 x 96)개까지 가능 *3: NextSeq®, MiniSeq™ 시퀀서로 시퀀싱분석을 적용할 경우, 샘플에 Control DNA (PhiX) 추가 필요 
그림 1. SMART-Seq®v4 3" DE Kit를 이용한 cDNA 합성과Library 제작 cDNA (black) is synthesized with a blocked (black star) and modifiedoligo(dT) primer that adds sequences for subsequent amplification and analysis-an in-line index (magenta), part of the Illumina read primer 2sequence (RP2, yellow), and the SMART IIA sequence (green). The SMART IIAsequence is used as a priming site during cDNA amplification, the Illumina RP2 sequenceis used as a priming site during library amplification, and the in-line indexis used for demultiplexing pooled samples during analysis. The process works asfollows: first, the template for SMARTScribe reverse transcriptase switchesfrom the mRNA (blue wavy line) to the SMART-Seq v4 Oligonucleotide (green).After reverse transcription, the full-length cDNA is amplified by PCR withblocked Primer IIA oligonucleotides. After cDNA amplification, the presence ofthe in-line index (magenta) allows for pooling of up to 12 samples. The pooledsamples are tagmented and Illumina Nextera read primer 1 and 2 sequences areadded by the Nextera Tn5 transposon (TnRP1 and TnRP2, orange and purplerespectively). The 3" ends of the original mRNA are captured by selective PCRwith primers for the TnRP1 and RP2 sequences. Other products of thetransposon-based reaction are not amplified, either because there are no primersites for amplification or because of suppression PCR. Cluster generation (pinkand dark purple) and indexing sequences (light blue and dark blue) are addedduring this PCR stage to generate a library ready for sequencing on an Illuminaplatform.
SampleID | Pool | In-lineIndexes | |||||||||||
i1 | i2 | i3 | i4 | i5 | i6 | i7 | i8 | i9 | i10 | i11 | i12 | ||
mtRNA(%) | 3.3 | 3.1 | 3.6 | 1.7 | 3.9 | 4.1 | 1.8 | 2.5 | 2.8 | 5.5 | 4.1 | 2.7 | 4.8 |
rRNA(%) | 0.6 | 1.2 | 0.7 | 1.1 | 0.4 | 0.4 | 0.3 | 0.3 | 0.7 | 1.2 | 0.5 | 0.1 | 0.6 |
Uniquely mapped reads(%) | 69 | 68 | 68 | 70 | 68 | 71 | 71 | 72 | 68 | 69 | 69 | 74 | 69 |
Total mapped reads(%) | 97 | 96 | 98 | 97 | 97 | 98 | 98 | 98 | 96 | 97 | 96 | 98 | 98 |
Number of reads(M) | 21.6 | 2.3 | 5 | 1.3 | 2.2 | 2 | 1.9 | 0.8 | 1.3 | 0.6 | 0.2 | 1.5 | 1.6 |
표 1.K562 single cell로부터 제작된 pooled library의 mapping read (%)K562 cells were diluted to one cell/μl in PBS buffer and twelve singlecells were isolated, checked via optical microscopy, lysed,and subjected tocDNA synthesis. The pooled libraries were sequenced on an Illumina MiSeqinstrument with 47 bp for read 1 and 26 bp for read 2. The pooled librarieswere demultiplexed based on the in-line barcode sequence from read 2. Alllibraries were mapped with STAR v.2.3.0.1 (Dobin et al. 2013) against the humangenome (hg19). The reads map to the genome at a high rate (>96%) with asmall proportion mapping to rRNA or mitochondrial (mt) regions.
□ Applications
cDNA synthesis for end-capture mRNA-seq for differential expression analysis of single cells.
□ 구성품
SMART-Seq v4 3" DE Kit Components SeqAmp™ DNA Polymerase
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既说像坐标画曲线曲线应纵轴该荧光强度吧轴数值变化代表荧光强度变化荧光强度变化代表钙离浓度变化 我觉直接用荧光强度值变化代替钙离浓度变化研究意义该钙离浓度变化吧
非要荧光强度值换算钙离浓度需要做列工作
1 取标准钙离浓度染色用共聚焦显微镜测荧光强度
2 标准品需要同像环境主要曝光间相同激光波及能量
3 标准品要用同浓度荧光染料
才能根据标准荧光强度关系推算品钙离浓度
1.怎么看两个反应－即目标基因和内参基因是否具有相同的扩增效率？
2.每次PCR反应的扩增情况都有差异，多次反应的扩增效率岂不是都不一样了吗？
3.如何设计才能让相对定量更可行？
由于对定量PCR的接触不多，希望各位高手多多帮助！谢谢！
什么是纯荧光校正，多长时间校正一次：
纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度，通俗地说是让仪器“认识”各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。以后每次定量实验运行过程中，SDS软件收集样品的原始光谱信号，并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较，精确扣除不同染料的信号重叠部分，从而确定样品中的荧光染料种类和信号强度。
推荐每半年进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前，请先进行背景校正和ROI校正。
