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제품특징
SMARTer RACE 5"/3" Kit(634858, 634859)는 SMARTer RACE cDNAAmplification Kit (Code 634923, 634924)의 대체품입니다RapidAmplification of cDNA Ends (RACE)는 RNA의 full-length sequence를 얻기 위해 사용되는기술이다. RACE는 RNA의 일부 알고 있는 부위 (small known sequence)를 이용하여 미지의 5’ 말단 (5’ RACE-PCR법), 3’ 말단 (3’ RACE-PCR법)을 규명하는데 적합한 기술이다. 본 제품 SMARTer RACE 5’/3’ Kit은 SMARTer 기술을 이용한 RACE cDNA 합성 키트로써 별도의 adaptor ligation 없이도짧은 시간 내에 full-length의 cDNA를 합성할수 있다. 합성된 cDNA는 5’ RACE-PCR과 3’ RACE-PCR에 적용할 수 있다. SMARTerRACE 5’/3’ Kit은 기존 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit보다 더 낮은background와 높은 특이성(higher specificity)을 보이는 제품이다. 또한 기존 제품에 비하여 농도가 낮은 RNA 샘플 (Input volume up to 11ul)도 사용 가능하며, Longfragment이거나 GC-rich template와 같은 증폭이 어려운 서열도 효율적으로증폭 가능하다. 본 제품 내에는 SeqAmp DNAPolymerase, In-Fusion HD Cloning kit, linearized vector, competent cell까지포함되어 있다.
□ 특징
● Easy to Use - performed in a single tube, and minimizes handling of both your RNA sample and your synthesized cDNA.
● Complete Kit - contains all the necessary components (save gene-specific primers) to streamline your process.
● Requires Only 10 ng of Total RNA - utilize small samples, including biopsies, tissue dissections, needle aspirations, and embryonic and rare disease tissues.
● Specific Enrichment for 5" EndsOur carefully designed, chemically-treated SMARTer Oligo preferentially hybridizes to the 5" ends of the cDNA being synthesized. Using this SMARTer Oligo, our procedure enriches cDNA pools for 5" sequences.
● No RNA Pretreatment Required - requires no RNA pretreatment with DNase. This protocol works with total RNA, as wellas with samples that may be contaminated with genomic DNA.
그림1. Overview of the SMARTer RACE 5"/3" Kit workflow.Each kit is a complete system, containing the reagents required to recovercloned RACE fragments on the second day. 그림 2. SMART(er) cDNA synthesis compared to conventional cDNAsynthesis. 그림3. SMARTer 5"- and 3"-RACE results for different genes. Lane 1: 1 kb DNA marker. Lane 2: 100 bp DNA marker. Lanes 3 &4: tyrosyl-tRNA synthetase (YARS). Lanes 5 & 6: interferon gamma receptor 1(IFNGR1). Lanes 7 & 8: adrenergic,beta, receptor kinase 1 (ADRBK1). Lanes9 & 10: actin, beta (ACTB). Lanes 11 & 12: transferrin receptor (TFR) Lane13: low density lipoprotein-related protein 2 (LRP2). Lane 14: low densitylipoprotein-related protein 1 (LRP1).
□ 적용
● RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)
● Identification of 3"/5" UTRs
● Full-length gene cloning
● Gene cloning and analysis
ebiomall.com
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我做的是用锁式探针来检测dna模板的ram,探针80base,其中杂交区40base,引物分别为16、18base,连接酶选取的T4 ligase和Taq DNA ligase两种,分别对应恒温和变温情况下的扩增。水解体系为EXO I和Exo Ⅲ的混合体系,参考的外文文献,应该没什么问题。聚合酶用的是Bst DNA大片段聚合酶。
一开始选择的探针浓度为200pmol/L,扩增效果挺好,当时用的DNA模板是质粒阳性标准品,但是后来在做敏感性的时候发现条带梯度差异几乎没有,而且阴性也出带,后来就没法做敏感性和特异性验证了,实验停滞了2个月一直也没进展。
按理说RAM借助锁式探针扩增的独特方式以及水解体系的存在可以有效防止污染才对,希望大家给点建议该如何解决。
万分感谢!!!!!!!!!!
附一张以前做敏感性的图(marker为2000的DNA ladder)以做参考
这里所说的一个碱基的差异该怎么检测?如何理解?
原理?(没有就算了...)
答的好的提高悬赏50分
有原理的追加50分
谢谢啊~~~~
同一温度下,首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸(RNA)的一个双链DNA拷贝,然后利用T7RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个(100~1000个)RNA拷贝;每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环;还可以加入荧光探针(分子信标),带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合,产生荧光。该荧光信号可由实时荧光PCR仪实时捕获,直观反映扩增循环情况。
SAT检测技术的优势
→先进的恒温扩增技术
核酸扩增在一个温度下进行(42℃),无需热循环。
→领先的RNA检测技术
SAT技术直接以病原体特异性RNA为扩增靶标,以扩增产物RNA为检测靶标,在实际应用中更显优势意义。
→更高的检测灵敏度和准确性
SAT技术的扩增效率极高,15~30分钟即可将模板扩增109倍,检测灵敏度和准确性远高于其他核酸检测技术。扩增时间短,效率高。
→有效减少假阴性结果
SAT技术采用M-MLV逆转录酶和T7RNA多聚酶进行核酸扩增,相对于其它核酸扩增技术,反应抑制物更少,有效减少假阴性结果。
→有效的解决了扩增产物的污染问题
由于扩增产物为RNA,环境中极易降解,从而大幅度提高检测结果的可靠性。
→大大降低了核酸扩增实验室的要求