重结晶提纯实验资讯
| 实验材料 | 精胺或4.0〜8.OmmolL亚精胺肌氨酸激酶新鲜麦胚沙粒 试剂、试剂盒 | 提取缓冲液平衡缓冲液DEFC10X能量缓冲液乙酸钾DTTLHEPESmRNA[3H]或[35S]标记的L-氨基酸三氯乙酸（TCA)。 仪器、耗材 | SephatkxG-25(粗级）高温烘箱低温冰箱高速离心机研钵电泳装置 实验步骤 | 一、材料与设备 (一）麦胚提取物的制备 1)新鲜麦胚:约5g 2)沙粒：约5g 3)提取缓冲液：20mmol/LHEPES(pH7.6)，100mmol/LKC1，1mmol/L乙酸镁，2mmol/LCaCl2, 6mmol/L2-巯基乙醇 4)平衡缓冲液：20mmol/LHEPES(pH7.6)，120mmol/LKCl,5mmol/L乙酸镁，6mmol/L2-巯基乙醇 5)SephatkxG-25(粗级） 6)DEFC 7)高温烘箱 8)低温冰箱 9)高速离心机 10)研钵 (二）mRNA在麦胚提取物的翻译 1)10X能量缓冲液：10mmoL/LATP，20umol/LGTP,80mmol/L磷酸肌氨酸.应使用核苷三磷酸钾盐，并用NaOH调节pH至7.4〜7.6。 2)0.5〜1.0mol/L乙酸钾，25mmol/L乙酸镁。 3)20mmol/LDTT。 4)0.2moL/LHEPES，pH7.4〜7.6。 5)0.6〜1.2mol/L精胺或4,0〜8.Ommol/L亚精胺， 6)mRNA:按前面章节所述方法获得。 7)200〜500ug/ml肌氨酸激酶。 8)[3H]或[35S]标记的L-氨基酸：为了检测翻译产物，在反应体系中加入一种经10〜50pCi 放射性标记的并且在翻译产物中含量丰富的氨基酸。合适的比活分别是[3H]标记的氨基酸：140Ci/mmol ,[35S]标记的氨基酸1Ci/mmol.放射性氨基酸应是水溶液，因为乙醇、盐、去污剂和某些溶剂都会干扰翻译。乙醇应通过冷冻干燥除去；其他成分对翻译的影响应经过事先分析确定。[35S]标记的氨基酸必须小量分装后置一70°C保存，这样可以稳定保存六个月，一旦过此期限，其中的降解产物即亚砜类物质就会对翻译产生抑制作用。 9）三氯乙酸（TCA)。 10)电泳装置。 二、操作方法 (一）麦胚提取物的制备 由于麦胚体外翻译系统的组分对温度十分敏感，故应于一70°C以适当体积分装保存，并尽量减少冻融次数。整个实验过程都应在灭菌条件下进行。为了防止RNase污染，所用器材需经高温处理(25C°，8h)或先经DEPC处理，然后用灭菌蒸馏水彻底清洗。制备过程须在4°C进行；最好使用塑料容器，因为起始因子容易粘在玻璃器皿上 1)将新鲜麦胚（约5g)与等质量的沙粒混合，并逐渐加入28ml提取缓冲液一起研磨。 2)混合物以28OOOg在2℃、pH6.5的环境中离心10min,pH6.5这样的pH可防止内源mRNA从多聚梭糖体释放下来，因而也就无需预先温育以促使多聚核糖体的形成。 3)将上清液加到用平衡缓冲液平衡的SephadexG-25凝胶柱上，洗脱回收，以去除内源氨某酸和对翻译有抑制作用的植物色素。然后，对凝胶柱进行反向层析，以回收凝胶柱中的氨基酸。 4)合井OD260>20的组分，以OD260约为100的浓度分装，保存于一70℃。提取物翻译活性可以保持一年以上。 (二）mRNA在麦胚提取物中的翻译 所有制备操作都应在冰上进行。齐种组分用过后的剩余部分应用干冰快速冷冻。反应在灭菌塑料微型离心管中进行 1)混合下列溶液(总最60ul):5ul能量混合液，5ul乙酸钾/乙酸镁溶液，5ulDTT，5ulHEPES,5ul精胺,10ul(0.3〜8.0ug)mRNA水溶液，10ul麦胚提取物，lOul肌氨酸激酶(〇D260=0.8〜1.0)和5ul[5H]或[35S]标记的L-氨基酸。肌酸激酶应最后加入以避免能量浪费。轻微振荡离心管使溶液混匀。如果需要，可在肌酸激酶之前加入微粒体膜(OD260=0.5)以检测翻译产物的修饰加工作用. 2)于28℃保温lh。置4℃终lh反应进行。 3)取一部分反应液进行TCA沉淀以检査放射性氨基酸掺入翻译产物的情况 4)对剩余的体外翻泽产物可通过离子交换层析等实验做进一步的分析。但对于专-性的产物，可先进行免疫沉淀，然后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 注意事项 | 1)提取物的翻译活性随不同批号的麦胚材料不同而不同。 2)麦胚提取物系统中外源mRNA刺激的放射性氨基酸掺入翻译产物的效率一般没有网织红细胞裂解液屮的高。 3)麦胚提取物的翻译活性对钾离子浓度的变化特别敏感.钾离子浓度低于70mmol/L时，比较小的mRNA优先得到翻译，而较大的mRNA的完全翻译则要求70mmol/L或更髙浓度的乙酸钾。在适当的离子条件下，能合成大到200kDa的多肽。另外，由于氯离子对翻译有抑制作用，所以最好使用乙酸钾。RNA制备物中残留的钾离子应逋过70%乙醇洗涤彻底除尽， 4)由于大部分内源氨基酸都已通过SephadexG-25凝胶层析被除掉，所以根据所用麦胚提取物的量，有时可能有必要加入氨基酸(终浓度25uol/L和/或tRNA(终浓度58ug/ml)以使其翻译活性最优化 5)加入精氨或亚精胺通常能促进翻译，尤其是对子合成较大的多肽更为必需，这可能是因为它们对较大的mRNA分子具有稳定作用。若省略精氨或亚精胺，则需将乙酸镁的最适浓度提高到4.0〜4.3mmol/L。 6)对麦胚提取物体外翻译系统来说，HEPES的缓冲效果比Tris-乙酸好。如果使用后者，则钾离子和镁离子的最适浓度都需随之改变。 7)有些商品化的肌氨酸激酶存在着不同程度的核酸酶污染，因此，如果肌氨酸激酶的用量较大，必须考虑到这一点。 8）较大的mRNA在下加热1min,然后在冰上快速冷却，这样可以提高它们在麦胚提取物系统中的翻译效率。 9)向翻泽反应系统屮加入狗胰腺微粒体膜可检测翻译产物的加工过程。 10)mRNA刺激的放射性氨基酸掺入翻评产物的过程是线性的：先有一个5min的延滞期，接着是的线性t：升期dOmin后此过程全部完成。这一系统在高于30℃的温度屮是不稳定的，其最高活性随不同批号的麦胚提取物制品而异，其孵肓温度一般在25〜30℃之间。而常用的孵育温度是28℃ 11)为得到最高的翻译活性，须对每一次的麦恥提取物制品分别确定其最佯的反应条件，包括mRNA浓度、钾离子和镁离子浓度以及孵存温度等，还须考虑麦胚提取物柱层析洗脱液中各种盐的浓度。 |
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发布于 ： 2018-08-05
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