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| 实验方法原理 | 本方案用磷酸酶去除核酸的5"磷酸根，然后在T4噬菌体多核苷酸激酶的催化下，以放射性标记的形式重新将磷酸加到核酸上，这是一种广泛应用于32P标记探针的技术。 | ||||||
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| 实验材料 | T4噬菌体多核苷酸激酶DNA 试剂、试剂盒 | 乙酸铵EDTA乙醇T4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液 仪器、耗材 | 液体闪烁计数仪SephadexG-50离心柱SephadexG-50柱 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 乙酸铵（10mol/L) EDTA(0.5mol/L，pH8.0) 乙醇 2.酶和缓冲液 T4噬菌体多核苷酸激酶 10XT4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液 3.核酸和寡核苷酸 DNA(10~50pmol) 4.放射性复合物 [γ-32P]ATP(10mCi/ml，比活性为3000~7000Ci/mmol） 5.专用设备 液体闪烁计数仪，可通过契仑科夫辐射测量32P SephadexG-50离心柱，用TE(pH7.6)平衡 或 SephadexG-50柱（1ml)，用TE(pH7.6)平衡 二、方法 1.在一个微量离心管中混合下列试剂： 去磷酸化的DNA 10~50pmol 10XT4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液 5μl 10mCi/ml[γ-32P]ATP (比活性为3000~7000Ci/mmol) 50pmol T4噬菌体多核苷酸激酶 10单位 水 加至50μl 37℃温育反应1h。 2.加入2μl0.5mol/LEDTA(pH8.0)以终止反应。用液体闪烁计数仪中的契仑科夫计数测量反应混合物中的总放射性。 3.通过以下任一方法分离放射性标记探针与未掺入的dNTP： 用SephadexG-50离心柱层析 或 用1mlSephadexG-50柱（用TE平衡）常规尺寸排阻层析 或 用乙酸铵和乙醇对放射性标记的DNA进行两轮选择性沉淀 4.通过契仑科夫计数测定探针制品中的放射性量，用探针中放射性含量除以反应混合物中的放射性总量来计算放射性标记物转移到5"端的效率。 |
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发布于 ： 2018-08-10
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