细胞生物学考试押题及参考答案(1)
| 实验材料 | 细胞 试剂、试剂盒 | 蛋白酶抑制剂裂解缓冲液解聚缓冲液组装缓冲液 仪器、耗材 | 匀浆器 实验步骤 | 1.从培养皿或瓶中吸去培养基并用5ml含蛋白酶抑制剂的冰冷的PBS洗细胞。  2.每75cm2瓶或培养皿用1ml冰冷的裂解缓冲液5分钟裂解细胞。 裂解缓冲液： 在PBS中加入： 1%Triton-X-100 0.6mol/LKCl 10mmol/LMgSO4 3.每ml细胞裂解液加0.5mgDNA酶Ⅰ，4℃冰浴5分钟或冰浴至细胞裂解物的黏滞度明显降低。 4.4℃下以1500g离心裂解物10分钟。 5.用含有蛋白酶抑制剂并且含5mmol/LEDTA的PBS洗沉淀物两次。 6.沉淀物在解聚缓冲液中混匀（蛋白终浓度应该大约为1mg/ml）并在20℃搅拌30分钟。 解聚缓冲液： 10mmol/LTris-HCl，pH8.0 8mol/L尿素 0.2%β-巯基乙醇 5μmol/LEDTA 7.匀浆了的沉淀物在20℃以200000g离心30分钟。 8.用适当的组装缓冲液透析上清（蛋白浓度应该大概为0.5mg/ml)来促进中间丝的组装。Ⅰ型和Ⅱ型或者Ⅲ型中间丝至少在20℃透析3小时。 用于Ⅰ型和Ⅱ型中间丝蛋白（角蛋白）的组装缓冲液： 10mmol/LTris-HCl，pH7.4 0.2%β-巯基乙醇 用于Ⅲ型中间丝蛋白的组装缓冲液： PBS 9.透析了的制品在4℃以100000g离心30分钟，回收聚合了的中间丝沉淀物。 10.重复2或3次步骤6~9以减少除中间丝蛋白或中间丝相关蛋白以外蛋白质的量。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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