犬白细胞介素10(IL10)酶联免疫分析 ELISA kit技术交流上海裕...
| 实验材料 | 大鼠 试剂、试剂盒 | CMF-Hanks液胰蛋白酶DMEMF12 仪器、耗材 | 水浴锅培养箱 实验步骤 | 一、原代培养 1. 选用生后1周的新生大白鼠，用碘酒,酒精棉球消毒，断头取其大脑皮层组织。 2. 解剖显微镜下，剥离脑膜，切除大脑髓质部分。 3. 将大脑皮质在无Ca2+、Mg2+Hanks液(CMF-Hanks液)中剪碎。 4. 室温下静置10min。 5. 在37℃水浴箱中用0.125%的胰蛋白酶(用CMF-Hanks液配制)消化30min。 6. 加入少许含20%血清的DMEM/F12(DMEM与F12为1:1)混合培养液(下同)，用吸管稍加吹打至胰酶液与培养液混匀。离心5min(1000r/min)。 7. 吸去上清含酶液，重新加入含血清培养液，用吸管反复吹打至组织块消散为止。制成细胞悬液(暂称初细胞悬液)。 8. 将初细胞悬液接种到玻璃瓶(或培养皿)中，于37℃、5%CO2培养箱中孵育30min。 9. 翻转培养瓶,吸出瓶中的细胞悬液。用孔径为75μm的不锈钢网过滤。 10. 将滤过液离心10min(1000r/min)，浓缩成约3ml的细胞悬液(暂称为次细胞悬液)。 11. 将次细胞悬液种植到预先涂布有多聚赖氨酸的培养瓶中。接种的细胞密度约1×104个/cm2。 12. 置CO2培养箱中培养3-5h,再补加足够的培养液,继续培养9-14h。培养液颜色略微变黄时换液。 二、原代培养物的传代 1. 吸取旧培养液用CMF-Hanks液洗涤2次。 2.加入少许0.125%的胰蛋白液消化15min。以有血清培养液终止胰酶活性。 3.稍事手动摇晃,倒掉含酶液。加入有血清培养液。 4.用吸管反复吹打使细胞从培养瓶壁脱落。收集细胞悬液,离心10min(1000r/min)。弃上清液，给细胞沉淀物再加入培养液制成细胞悬液。 5.重复原代培养时8-10步。 6.将细胞悬液按0.5×105个/cm2的密度种植在经鼠尾胶原包被的培养瓶中。 7.送入CO2培养箱中培养3-5h，再加足够的培养液,继续培养。 三、结果 分离的大鼠大脑皮质细胞在原代培养4h后，部分细胞即可长出细小胞突。培养3-4d之后，细胞数量便明显增大。大鼠大脑皮质细胞原代培养一般在9-14d，以星形胶质细胞为主的细胞即可长满培养瓶壁。 |
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发布于 ： 2021-09-03
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