第1阶段：用于MOS和XmaⅠ消化的PCR扩增

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

EDTA,0.2mol/L

矿物油

TN缓冲液（10mmol/LTris-HCl、pH7.6，10mmol/LNaCl)

2.酶和酶缓冲液

PCR缓冲液，10X(40mmol/LTricine-KOH、22°C下pH9.2,3.5mmol/L乙酸镁，10mmol/L乙酸钾，75mg/mlBSA，或者厂商提供）

聚合酶混合液，50X(Advantage2，Clontech，或相当产品）

XmaⅠ(10U/ul)

XmaⅠ缓冲液，10X

3.核酸和寡核苷酸

DNA

dNTP溶液（包含所有4种dNTP，各10mmol/L)

各稀释的第二次杂交样品（来自方案2第17步）

PCR引物P1

PCR引物NP2R

PCR引物P1

4.专用设备

热循环仪

水浴，预设为37°C和74°C

5.附加试剂

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

酚：氯仿抽提和乙醇沉淀所需的试剂

二、方法

1.用于MOS的初级PCR扩增

(1)从每个稀释的第二次杂交产物中（来自方案2第17步）各取10ul，加到标记好的管子中。

(2)按照下表，配制用于初级PCR-1的主体混合液。这个配方足够做一个反应。根据要按比例扩大。对于每个反应，按照下表将试剂混合。



(3)混匀，并短暂离心。

(4)将115ul主体混合液分装到第1步的反应管中。

(5)将最终的125ul混合液，分装到5个0.5ml(原文为ul—译者改）的PCR管中(每管25ul)。

(6)用1滴矿物油覆盖。

(7)将反应混合液在热循环仪中74°C温育5min，以延伸接头，然后立即开始以下循环。



(8)从5个初级PCR-1产物中，各取2ul到一个管中混合，并加390ulH₂0。

(9)从第8步稀释的每个初级PCR-1产物混合液中，各取1ul到一个标记妤的PC管中。

(10)按照下表，配制用于初级PCR-2的主体混合液。



(11)混勻，并短暂离心。

(12)将24ul主体混合液分装到第9步的各反应管中。

(13)用1滴矿物油覆盖。

(14)立即开始以下循环。



(15)从每个反应产物中，各取4ul在2.0%琼脂糖凝胶上分析。

2.用于MOS的次级PCR

(16)从上面第14步产生的每个初级PCR-2混合液中，各取2ul,用38ulH₂0稀释。

(17)从每个稀释的初级PCR-2产物混合液中，各取2ul，分装到标记好的管子中。

(18)按照下表，配制用于次级PCR的主体混合液。这个配方足够做一个反应，根据需要按比例扩大。对于每个反应，按照下表将试剂混合。



(19)混匀，并短暂离心。

(20)将48ul主体混合液分装到第2步的反应管中。

(21)用1滴矿物油覆盖。

(22)立即开始进行10~12个循环：95°C10s，68°C10s,72°C1.5mm。

(23)从每个反应产物中各取4ul在2.0%琼脂糖凝胶上分析。

(24)用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀纯化次级PCR产物。

(25)用20~40ulTN缓冲液溶解沉淀，使DNA浓度为20ng/ul

(26)取2ul纯化的PCR产物，在2.0%琼脂糖/溴化乙锭凝胶上分析。

(27)用1.6mlH₂0稀释14第10步纯化的PCR产物（这将作为未消化的对照）。

(28)反应产物保存在-20°C。

3.XmaI消化

(29)在管中加入下列试剂



(30)混匀，然后在37°C温育2h。

(31)加入2ul0.2mol/LEDTA，以终止反应。

(32)74°C温育5min,使酶失活。

(33)-20°C保存。

第2阶段：MOS杂交

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

稀释缓冲液（20mmol/LHEPES-HC1、pH8.3,50mmol/LNaCl和0.2mmol/LEDTA)

4X杂交缓冲储存液：4mol/LNaCl，200mmol/LHEPES、pH8.3,4mmol/L十六烷

基三乙基溴化铵（CTAB)，最终的1X杂交混合液用稀释缓冲液来稀释矿物油

2.核酸和寡核苷酸

XmaI消化的DNA

3.专用设备

热循环仪

二、方法

1.在一个1.5ml的离心管中，混合以下试剂。



2.从混合液中，取2ul到一个0.5ml的离心管中，用1滴矿物油覆盖。

3.在热循环仪中98°C温育1.5min。

4.在热循环仪中68°C温育3h。

5.在管中加200ul稀释缓冲液，并吹吸混匀。

6.在热循环仪中70°C加热7min。

7.-20°C保存。

第3阶段：MOSPCR扩增

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

dNTP溶液（包含所有4种dNTP,每种为lOmmol/L)

矿物油

2.酶和酶缓冲液

PCR缓冲液，lOX（4Ommol/LTricineKOH、22°C下pH9.2，3.5mmol/L乙酸镁，10mmol/L乙酸钾，75mg/mlBSA,或者厂商提供）

聚合酶混合液，50X(Advantage2,Clontech,或相当产品）

3.核酸和寡核苷酸

稀释的DNA样品（杂交后的样品及相应的未消化对照，方案4第2阶段第6步和方案4第1阶段第26步）

MOSPCR引物（NP2Rs)

4.专用设备

热循环仪

5.附加试剂

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

二、方法

1.按照下表，为所有的MOSPCR配制主体混合液。



2.在标记好的含有24ul主体混合液的管子中，各加lul稀释的DNA样品（杂交后样品及相应的未消化对照）。

3.用1滴矿物油覆盖。

4.将反应混合液放在热循环仪中，74°C温育5min,以延伸接头（不要将样品从热循环仪中取出）。

5.立即开始下面的循环。

6.从每个管中，各取4ul在琼脂糖凝胶上分析。

7.反应产物保存在-20°C。