蛋白质检测-WesternBlot 1.把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1)转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜,将硝酸纤维素膜铺在凝胶上,用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2)在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸(预先用转移缓冲液浸湿),将凝胶夹在中间,保持湿润和没有气泡。 3)将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中,凝胶面向阴极。 4)将上述装置放入缓冲液槽中,并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5)按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6)转移结束后,取出薄膜和凝胶,弃去凝胶。 2.将薄膜漂在氨基黑中快速染色,直至分子量标准显现时取出,记录下标准位置。 3.用100ml水洗涤纤维素膜,必要时可用脱色缓冲液。 4.膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5.室温下,用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6.用封口机将薄膜封入塑料袋中,尽可能不留空气。 7.袋的一角剪一缓冲液的小口,用透析袋夹紧。 8.混合:NGS(100微升),印迹缓冲液中的抗体(10毫升),加在装薄膜的袋中,于室温下摇动2小时(或4℃过夜) 9.用总体积300mlPBS-Tween缓冲液,分4次在一浅盘中洗涤薄膜,每次75ml。 10.将连接生物素的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS)加在袋内,于室温下摇动1小时。 11.按步骤9洗涤。 12.加入抗生素蛋白-HRP(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS),于室温下摇动1小时。 13.按步骤9洗涤。 14.配制显色指示剂/底物:混合显色指示剂原液3.0ml,PBS9.0ml,加入1%过氧化氢150.0微升。立即使用。 15.于室温下摇动直至出现紫色并开始看到背景(1~10分钟)。 16.将薄膜转到另一盛水容器中洗涤,终止显色反应,空气干燥,封入塑料袋中避光保存。