EpiVaginalprovidesaninvitroresearchtoolbothforfeminineproductsafetytestingandforthestudyofHIV-1andothersexuallytransmitteddiseases.Itstissuestructureandcellularphysiologycloselyparallelinvivovaginalepithelialtissue,makingitidealfortoxicologyandefficacytesting,aswellasatoolforBIOLOGicalresearch.
Technology:
EpiVaginaltissuesareculturedfromnormal,human-derivedvaginalepithelialanddendriticcells.Itshighly-differentiatedstructureparallelsinvivotissueandisidealfortoxicitystudiesoffemininehygiene,vaginalcare,andmicrobicideproducts.FourtypesofEpiVaginalareoffered:
1)VEC-100(Figure1):AnepithelialtissuecontainingepithelialVECcells,
2)VLC-100(Figure1):ApatentedepithelialtissuecontainingepithelialVECandimmuno-competentdendriticcells,
3)VEC-100-FT(Figure2):AfullthicknessversionofVEC-100whichincludesVECepithelialcellsandafibroblast-containinglaminapropria,and
4)VLC-100-FT(Figure2):Apatentedimmuno-competentversionoftheVEC-100-FTwhichincludesdendriticcells.
Figure1:H&Estainedhistological(formalinfixed)cross-sectionsofA)VEC-100invitroreconstructedepithelialtissuemodelscontainingnormalhumanVECcells,andB)vaginalexplanttissue.Bothinvitroandinvivotissuesshownucleatedbasalandsuprabasalcelllayersfollowedbylayersinwhichnucleiarelostandcellsarefilledwithglycogen.
Figure2:H&Estainedhistological(formalinfixed)crosssectionsoffull-thicknessEpiVaginaltissues.TheVEC-100-FTtissuesconsistofVECepithelialcellsculturedatopalaminapropria(LP)-likecollagenmatrixthatcontainsfibroblasts.TheVLC-100-FTconsistsofVECepithelialanddendriticcellsintheepitheliallayersandcontainsbothfibroblastsanddendriticcellsintheLP.
Figure3:Formalinfixedcross-sectionsoftheVEC-100tissueimmuno-stainedforcytokeratins,CK13,CK14,&CK18.BasalcellsarestainedbyCK14andsupra-basalcellsbyCK13;nocellsarestainedbyCK18.
Figure4:ViABIlity(A)andCytokineRelease(B)offull-thicknessvaginalecto-cervical(VEC-100-FT)tissuemodelfollowingexposure(18hr)toformulationscontainingthecommonspermicidenonoxynol-9(N9):a)PBScontrolandb)KYjelly(KY,0%N9),c)KYN9(2%),andd)N9(0.1%).Asviabilityofthetissuedecreases,theIL-1βincreases.
Figure5:HIV-1infectionofVLC-100tissuefollowingtopicalexposure(24hr)to60,000CPMofHIV-1ADAorNL4-3virus.Afterexposure,tissueswerewashed3Xandthenculturedforanadditional24hr.CellularDNAwasthenextractedandHIV-1transcriptsweredetectedusingHIV-1gagspecificprimerpairs.
Figure6:RTPCRshowingToll-likeReceptor(TLR)expressionfor:A)organotypicvaginal-ectocervical(VEC)tissuemodelandB)Humancervicaltissueexplant.
Applications:
MicrobicideTesting,STDInfectionResearch,FeminineHygiene,Inflammation,DrugDelivery
EpiVaginalprovidesaninvitroresearchtoolbothforfeminineproductsafetytestingandforthestudyofHIV-1andothersexuallytransmitteddiseases.Itstissuestructureandcellularphysiologycloselyparallelinvivovaginalepithelialtissue,makingitidealfortoxicologyandefficacytesting,aswellasatoolforbiologicalresearch.BrowseourreferencelibrarytoseehowresearchershaveusedourEpiVaginaltissueintheseareasofstudy.
TechSpecs:
Tissue
Kits:TheEpiVaginalkitVEC-100contains24tissues,VEC-112contains12tissuesandVEC-606contains6tissues.(Tissue“kits”containtissues,asmallamountofculturemedium,andplasticware;contactMatTekforspecifickitcontents.)
Substrate:Singlewelltissuecultureplateinsertsareused.
VEC-100:Nunc™singlewelltissuecultureplateinserts.PoreSize=0.4µm,InnerDiameter=0.80cm,SurfaceArea=0.5cm2.
VEC-606:Polycarbonatesinglewelltissuecultureplateinserts,Nunc™.PoreSize=0.4µm,InnerDiameter=2.5cm,SurfaceArea=4.2cm2.
Culture:Atairliquidinterface.
Histology:VEC-100:10-16celllayersofnon-cornifiedtissue.
LotNumbers:Tissuelotsproducedbyeachtechnicianforeachweekareassignedaspecificlotnumber.Typically,therearemultiplelotnumbersforanygivenweek’stissueproduction.Aletterofthealphabetisappendedtotheendofthelotnumbertodifferentiatebetweenindividualkitswithinagivenlotoftissues.Alltissuekitswithinalotareidenticalwithregardtocells,medium,handling,cultureconditions,etc.
Shipment:At4°Conmedium-supplemented,agarosegels.
Shipmentday:Monday.
Delivery:TuesdaymorningviaFedExpriorityservice(US).OutsideUS:Tuesday-Thursdaydependingonlocation.
Shelflife:Includingtimeintransit,tissuesmaybestoredat4°Cforupto4dayspriortouse.However,extendedstorageperiodsarenotrecommendedunlessabsolutelynecessary.Inaddition,thebestreproducibilitywillbeobtainediftissuesareusedconsistentlyonthesameday,e.g.Wednesdaymorningfollowingovernightstorageat4°C.
Lengthofexperiments:Culturescanbecontinuedforatleast1weekwithgoodretentionofnormalmorphology.Culturesmustbefedeveryotherdaywith5.0mlofmaintenancemedium(VEC-100-MM).Cellcultureinsertsareplacedatopculturestands(partnumberMEL-STND)orwashers(partnumberEPI-WSHR)in6-wellplatestoallowtheuseof5.0ml.
Alternativetissues:
VEC-100-FT:SimilartoVEC-100excepttissuegrownonacollagen/vaginalfibroblastsubstrate(laminapropria).
VEC-112-FT:SimilartoVEC-100-FTexcept12tissues.
VLC-100:SimilartoVEC-100excepttissuescontainLangerhanscells.
VLC-112:SimilartoVLC-100except12tissues.
VLC-100-FT:SimilartoVLC-100excepttissuegrownonacollagen/vaginalfibroblastsubstrate(laminapropria).
VLC-112-FT:SimilartoVLC-100-FTexcept12tissues.
Cells
Type:Normalhumanectocervicalcells(NHEC)aredifferentiatedintotissueswithanon-cornified,vaginal-ectocervicalphenotype(partnumberVEC-100).
Geneticmake-up:Singledonor.
Derivedfrom:adulthumanectocervicaltissue.
Screenedfor:HIV,Hepatitis-B,Hepatitis-C,mycoplasma,bacteria,yeast,fungi.
Medium
Basemedium:Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium(DMEM)andF12Medium.
Growthfactors/hormones:Epidermalgrowthfactorandotherproprietaryfactors.
Serum:None.
Antibiotics:Gentamicin5µg/ml(10%ofnormalgentamicinlevel).
Anti-fungalagent:AmphotericinB0.25µg/ml.
pHIndicator:Phenolred.
Otheradditives:Proprietary.
Alternatives:Phenolred-free,antibiotic-free,anti-fungal-freemediumandtissueareavailable.Agentsareremoved3dayspriortoshipment.
Maintenancemedium:VEC-100-MM
QualityControlandSterility
Visualinspection:Alltissuesarevisuallyinspectedandifphysicalimperfectionsarenoted,tissuesarerejectedforshipment.
End-usetesting:TissueviabilityofeachlotisdeterminedbyanMTTassay.Tissuesareexposedto1.0%TritonX-100for30,60,and120minutes.Thetimeofexposurerequiredtoreducethetissueviability(ET-50)usingtheMTTassayisdetermined.Thetimeofexposureneededtoreducetheviabilityto50%(ET-50)mustbe0.92–1.67hours.AsummaryoftheQCtestingresultswillbeprovidedtothecustomerforreferenceuponrequest.(ForTEERmeasurements,MatTekhassuccessfullyusedtheWPIEndohmSystem.)
Sterility:Allmediausedthroughouttheproductionprocessischeckedforsterility.Maintenancemediumisincubatedwithandwithoutantibioticsfor1weekandcheckedforsterility.Theagarosegelfromthe24-wellplateusedforshippingisalsoincubatedfor1weekandcheckedforanysignofcontamination.
Screeningforpathogens:AllcellsarescreenedandarenegativeforHIV,hepatitisBandhepatitisCusingPCR.However,noknowntestmethodcanoffercompleteassurancethatthecellsarepathogenfree.Thus,theseproductsandallhumanderivedproductsshouldbehandledatBSL-2levels(biosafetylevel2)orhigherasrecommendedintheCDC-NIHmanual,“Biosafetyinmicrobiologicalandbiomedicallaboratories,”1998.Forfurtherassistance,pleasecontactyoursiteSafetyOfficerorMatTektechnicalservice.
Notificationoflotfailure:IfatissuelotfailsourQCorsterilitytesting,thecustomerwillbenotifiedandthetissueswillbereplacedwithoutchargewhenappropriate.BecausesomeofourQCandsterilitytestingisdonepost-shipment,notificationwillbemadeassoonaspossIBLe.(Undernormalcircumstances,ET-50failureswillbenotifiedbyThursday,5p.m.;sterilityfailureswillbenotifiedwithin8daysofshipment.)
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EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。
我做的课题与移植免疫耐受有关，目前在做的就是体外MLR。实验protocol如下：
供体小鼠（Balb/c）脾淋巴细胞经磁珠分选提取APC细胞，辐照灭活后作为刺激细胞。受体小鼠（C57）脾淋巴细胞经磁珠分选提取cd3细胞用CFSE标记作为反应细胞。调整供体细胞密度为5×10^6/ml，受体细胞密度为1×10^6/ml，分别按2:1，5:1，10:1的比例加入圆底96孔板，每组3个复孔，同时设单纯受体细胞和受体自身APC－cd3混合培养作为阴性对照组，37℃5%CO2共培养3天。共培养3天后收集细胞，3个复孔合并成一管，经PBS洗涤，加入CD3-PE流式抗体孵育标记T细胞，上流式细胞仪检测受体T细胞增殖程度。
结果：流式检测结果如下图所示，图3是各浓度梯度组间比较，想请教图中左侧是否为正常的增殖峰，因为此前多次结果均显示为宽大的单峰，未观察到所谓的细胞增殖峰，查阅之前的研究结果多数显示如未加细胞刺激物，单凭细胞的刺激作用形成的增殖相当微弱，极少呈现这样单个高尖的增殖峰。
图1
图2
图3（从上往下（黄、红、蓝）分别为5:1，2:1，10:1混合培养组）
单纯受体细胞的空白组没有增殖这个没有问题，但奇怪的是图4里作为阴性对照的反应组也是同样的双峰结果，尽管刺激效果不如前三组明显，但理论上用自身的APC刺激自身的cd3根本不会出现增殖，不知这样的结果是属于正常增殖还是假阳性结果，因为我们的阴性对照组细胞在镜下看被污染了，是否会受此影响表现为细胞增殖？
因本人刚接触免疫细胞实验不久，可能描述的问题比较小白，如有不当请大神们指正，非常感谢^^
图4（从下往下（黄、蓝、红）分别为空白组、5:1混合培养组和自身对照组）
如题。以及下面问题：
要检测转基因小鼠（不知道）和正常鼠细胞免疫的改变（T细胞）需要做那些实验？
自我复制也叫"自体复制"（self-duplication）．生物体内通过代谢作用，按照原有结构复制成为完全相同的结构的生物合成过程．例如脱氧核糖核酸（DNA)在生物体内以原有的DNA分子为模板,合成两个完全相同的DNA分子的过程.
细胞分裂（cell division）是指活细胞增殖其数量由一个细胞分裂为两个细胞的过程。分裂前的细胞称母细胞，分裂后形成的新细胞称子细胞。通常包括细胞核分裂和细胞质分裂两步。在核分裂过程中母细胞把遗传物质传给子细胞。
细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。检测
1.MTT。
MTT法检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan），而死细胞无此功能。用DMSO溶解甲臜后在490nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
MTT法检测细胞增殖算是比较常用的方法了，价格便宜，不过其甲瓒产物不溶于水，需有机溶剂溶解后方可检测，其增加了工作量，同时对结果的准确性产生影响，重复性较差吧。
2.CCK8
CCK8检测原理：CCK8中的主要成分WST®-8能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜，生成甲臜的量与细胞数成正比，可间接测定活细胞数量。
相比较于MTT而言，CCK8的灵敏度要更高，其生成的甲瓒产物溶于水，重复性和准确性上要优于MTT法，对于细胞的毒性较小，不过价格也是相比MTT要贵一截。
3.通过标记DNA检测细胞增殖的常用的大概是Brdu和EDU用的比较多。
Brdu是一种胸腺嘧啶核甘类似物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期）参入正在复制的DNA中，之后我们通过抗Brdu的抗体与荧光二抗快速检测细胞的DNA复制活性。EDU也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中，基于Apollo®荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性，类似于一种化学反应吧，而无需抗原抗体结合。
相比较而言，Brdu或者edu更适合用于siRNA、miRNA、小分子化合物及其药物筛选等。同时Brdu或者EDU也适用于小鼠，大鼠及其他动物模型的各种组织器官(血管除外)的细胞增殖检测。关于Brdu和EDU的各自优缺点可以参考下帖。具体问题具体分析吧，目前来看EDU检测越来越普遍吧。关于Brdu检测细胞增殖，一种可以使用免疫荧光通过Brdu-FITC与DAPI双染判断细胞的增殖情况。
一般对于细胞来说都是免疫荧光的常规步骤吧，只是需要一步盐酸进行变性DNA和中和。
1.细胞铺板24孔板或者6孔板。可以进行加药处理细胞
2.加入一定终溶度的BrdU继续培养一定的时间。随后弃去孔内溶液，PBS润洗3次。
3.4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS再润洗3次
4.0.1％TritonX-100处理细胞15min后，接着PBS润洗3次
4。接着2MHCl处理30min，再加入0.1M的硼酸中和10min，PBS润洗3次。
5.滴加5％BSA室温封闭30min，弃去液体，滴加1:200稀释的BrdU一抗，4℃孵育过夜。
6.次日，弃去一抗，PBS润洗5次，在避光条件下，滴加1:50稀释FITC标记二抗，室温孵育1h后，PBS再润洗5次。
7.pbs洗5遍，滴加DAPI溶液，室温孵育5到10分钟，PBS洗5遍。
8.荧光显微镜观察。拍照。只是需要注意的是细胞固定这一块吧，如果细胞固定不好的话，细胞容易连在一起而无法分清S期和M期等。同时容易造成细胞碎片吧。
附张失败的图片。
文献中完美的图片：
图片来源：EthanolinducescytostasisofcorticalbasalProgenitors
4.关于EDU，目前一般都是拿试剂盒做的，操作简单方便。步骤相比Brdu而言，少了DNA变性，无需抗体孵育等环节。
细胞分化，产生的是不同的细胞，例如造血干细胞可以分化出红细胞。
1，一个孔中应接种多少个细胞？
当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100μl培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
能否用384孔板进行试验？
2，可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量。
3，能否用24孔板进行试验？
可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。
4，酚红会影响检测吗？
不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
5，CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？
有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。
6，CCK-8能否检测细菌细胞？
可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100μlE.coli培养液中加入10μlCCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。
7，CCK-8稳定吗？
CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要长期保存，我们推荐-20℃的储藏条件。
8，如果没有450nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？
还可使用450nm到490nm之间的滤光片。
9，如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？
可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。
10，CCK-8是什么颜色？
应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。
以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒
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