Aninvitromodelofmelanomaenablesoncologistsandcancerresearchersabetterunderstandingofdiseaseprogression,andanefficientplatformfortestingnewtherapies.
Technology:
TheMelanomamodelconsistsofhumanmalignantmelanomacells(A375),normal,human-derivedepidermalkeratinocytes(NHEK)andnormal,human-deriveddermalfibroblasts(NHDF)whichhavebeenculturedtoformamultilayered,highlydifferentiatedepidermiswithmelanomacellsatvariousstagesofCMmalignancy.Atdifferentstagesoftheculture,thetissueexhibitsrADIalgrowthphase(RGP),verticalgrowthphase(VGP),ormetastaticmelanomaphenotype.Thecellsareculturedoncellcultureinsertsusingserumfreemedium,andattainlevelsofdifferentiationonthecuttingedgeofinvitroskintechnology.Structurally,theMelanomamodelcloselyparallelstheprogressionofmelanomainvivo,thusprovidingavaluabletooltostudy,understand,anddeveloppreventativeandtherapeutictreatmentsforoneofthemostseriouscutaneousmalignancies.
TheMelanomamodelexhibitsinvivo-likemorphologicalandgrowthcharacteristicswhichareuniformandhighlyreproducIBLe.Epidermisofthisfullthicknessskinmodelconsistsoforganizedbasal,spinous,granular,andcornifiedepidermallayersanalogoustothosefoundinvivo.Thedermalcompartmentiscomposedofacollagenmatrixcontainingviablenormalhumandermalfibroblasts(NHDF).
TheprotocolsforusingtheMelanomatissuesareclearandstraightforward.MatTek’sMelanomatissueshavebeenutilizedwithanumberoftargetandanti-melanomadrugs.
Figure1.HumanMetastaticMelanomaCells(A375)inFullThicknessMelanomaSkinModel.A375cellsdevelopRGPmelanomanodesatdermal/epidermaljunction(Day11).Withextendedculturetime,melanomanodesadoptaVGPmorphology(Day18)andsubsequentlyisolatedclustersofcellsinvadethedermis(metastaticinvasion)(Day29).Longarrowsindicatemelanomacellclustersattheepidermal-dermaljunction.Shortarrowsshowseparatedmelanomacellclustersinfiltratingthedermis.
Figure2.UltrastructuralanalysisofMelanomaFTSkinModel.
Transmissionelectronmicrograph(TEM)ofthefullthicknessskinmelanomamodel(MLNM-FT-A375).A.Areaofinteractionofmelanomacells(M)andkeratinocytes(KC).B.Areaofinteractionofmelanomacellsandtheunderlyingdermalsubstrate(D).N,nucleus,n,nucleoli.Arrowindicatesapoptoticmelanomacells
Figure3.Fullthicknessskinmelanomamodel(MLNM-FT)containingmetastaticSK-Mel-28cells.S-100antibodystaining.Initiallysmallnestsofmelanomacellsformatthedermal/epidermaljunction(Day11).LaterVGPtumorsdevelop(Day25),andsubsequentlymetastasisintothedermisisobserved(Day29).Longarrowsindicatesomeofthemelanomacellclustersattheepidermal-dermaljunction.Shortarrowsshowindividualmelanomacellsinfiltratingthedermis.
Figure4.ExpressionofN-CadherinAdhesionMoleculeinMLNM-FT-A375FullThicknessMelanomaSkinModel.N-Cadherinantibodystaining,40X.NoteincreasedlevelofN-Cadherinexpressionwithtimeinculture.
Applications:
TumorInvasionandAnti-MelanomaDrugScreening
MatTek’sMelanomatissueexhibitsradialgrowthphase,verticalgrowthphase,andmetastaticmelanomaphenotypes,parallelingtheprogressionofmelanomainvivo.Thismodelprovidesavaluabletoolforoncologistsandcancerresearcherstostudy,understand,anddeveloppreventativeandtherapeutictreatmentsforoneofthemostseriouscutaneousmalignancies.BrowseourMelanomareferencesintheMatTekReferenceLibrarytoseehowdoctorsandresearchershaveusedourMelanomatissue.
TechSpecs:
Tissue:
Kit:Fullthicknessmelanomaskinconstruct(MLNM-FT-A375kit)consistsof24tissues.(Tissue“kits”containtissues,asmallamountofculturemedium,andplasticware;contactMatTekforspecifickitcontents.)
Substrate:Singlewelltissuecultureplateinsertsareused(e.g.MillicellCMsinglewelltissuecultureplateinserts,poresize=0.4µm,surfacearea=0.6cm2).
Culture:Initiallysubmergedandthenattheairliquidinterface.
Histology:Epithelium:8-12epithelialcelllayersplusstratumcorneum(basal,spinous,andgranularlayers);Dermis:Collagengelcontainingfibroblasts.Atearlystagemelanomacellsformnodesatdermal/epidermaljunction.AtlaterstagesmelanomasprogresstoRGP(radialgrowthphase),VGP(verticalgrowthphase)andconsecutivelyinvadedermalcomponent.
Lotnumbers:Tissuelotsproducedeachweekareassignedaspecificlotnumber.Aletterofthealphabetisappendedtotheendofthelotnumbertodifferentiatebetweenindividualkitswithinagivenlotoftissues.Alltissuekitswithinalotareidenticalinregardstocells,medium,handling,cultureconditions,etc.
Shipment:Tissuesareshippedat4°Conmedium-supplemented,agarosegelsin6-wellplates.
Shipmentday:Monday.ShipmentonThursdayalsopossibleuponspecialrequest.
Delivery:TuesdaymorningviaFedExpriorityservice(US).OutsideUS:Tuesday-Thursdaydependingonlocation.
Shelflife:Includingtimeintransit,tissuesmaybestoredat4°Cforupto3dayspriortouse.However,extendedstorageperiodsarenotrecommendedunlessnecessary.Inaddition,thebestreproducibilitywillbeobtainediftissuesareusedconsistentlyonthesameday,e.g.Tuesdayafternoonorfollowingovernightstorageat4°C(Wednesdaymorning).
Lengthofexperiments:Culturescanbecontinuedforupto4weeksformelanomadevelopmentandprogressionwithgoodretentionofnormalepidermalmorphology.CulturesmustbefedeveryotherdayusingMatTekculturestands(MEL-STND;clickonthislinkforphoto)alongwith5.0mlofMLNM-FT-MM.
Alternativetissues:
MLNM-FT-A375(Day6):EarlystageMLNM-FT-A375tissue.TissuehasnotbeenculturedattheAir-LiquidInterface.Customerreceivesrequiredmedia(MLNM-FT-GM)tocontinueculturesandproduceMLNM-FT-A375.DiscussionwithaMatTektechnicalrepresentativeisrequiredpriortoorderingduetoproprietarynatureofthisproduct.Designedforstudyofearlystagesofmelanomadevelopmentinwhichexperimentaldesigndictatesuseofearlystagetissue.
MLNM-FT-EXP:SameasMLMN-FT-A375exceptMatTekreplacesA375cellswithcustomer-suppliedmelanomacells.
Cells:
Type:Humanmelanomacells(A375);Normalhumanepidermalkeratinocytes(NHEK);Normalhumandermalfibroblasts(NHDF).
Derivedfrom:Malignantmelanomacellline(A375);Neonatal-foreskintissue(NHEK);Neonatalskin(NHDF);
Alternatives:HumanmalignantmelanomacellsSK-Mel-28.
Screenedfor:HIV,Hepatitis-B,Hepatitis-C,mycoplasma.
Medium:
Basemedium:MCDB153BasalMedium.
Growthfactors/hormones:Epidermalgrowthfactor,insulin,hydrocortisoneandotherproprietarystimulatorsofepidermaldifferentiation.
Serum:None.
Antibiotics:Gentamicin5µg/ml(10%ofnormalgentamicinlevel).
Anti-fungalagent:AmphotericinB0.25µg/ml.
pHIndicator:Phenolred(0.0012g/l).
Otheradditives:Lipidprecursorsusedtoenhanceepidermalbarrierformation(proprietary).
Assay/Maintenancemedium:MLNM-FT-MMisutilizedforassaysaswellaslongtermmaintenanceoftheMLNM-FT-A375tissues.
QualityControlandSterility:
Visualinspection:Alltissuesarevisuallyinspectedandifphysicalimperfectionsarenoted,tissuesarerejectedforshipment.
End-usetesting:Tissuesfromtheproductionlotareretained,grownforadditional7days,fixedforhistology,andanalyzed.
Sterility:Allmediausedthroughouttheproductionprocessischeckedforsterility.Maintenancemediumisincubatedwithandwithoutantibioticsfor1weekandcheckedforsterility.Theagarosegelfromthe24-wellplateusedforshippingisalsoincubatedfor1weekandcheckedforanysignofcontamination.
Screeningforpathogens:AllcellsarescreenedandarenegativeforHIV,hepatitisBandhepatitisCusingPCR.However,noknowntestmethodcanoffercompleteassurancethatthecellsarepathogenfree.Thus,theseproductsandallhumanderivedproductsshouldbehandledatBSL-2levels(biosafetylevel2)orhigherasrecommendedintheCDC-NIHmanual,“BiosafetyinmicroBIOLOGicalandbiomedicallaboratories,”1998.Forfurtherassistance,pleasecontactyoursiteSafetyOfficerorMatTektechnicalservice.
Notificationoflotfailure:IfatissuelotfailsourQCorsterilitytesting,thecustomerwillbenotifiedandthetissueswillbereplacedwithoutchargewhenappropriate.BecauseourQCandsterilitytestingisdonepost-shipment,notificationwillbemadeassoonaspossible(Undernormalcircumstancessterilityfailureswillbenotifiedwithin8daysofshipment).
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1,CCK-8能否对活细胞进行染色?
不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐(WST-8),并通过电子载体PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的,因此CCK-8不能对细胞进行染色。
2,CCK-8检测溶液对细胞是否有毒?
CCK-8溶液自身因为高浓度的PMS的存在而具有一点毒性。但是,加到培养基中的CCK-8是没有毒性的,因为被稀释了10倍。因此,长时间的培养,如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测,如结晶紫检测,中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同,因此在需要进行长时间培养时,先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。
3,在做加药实验时,药物对测定是否有影响?如何解决?
有时会有影响。如果药物具有还原性,会和CCK8发生显色反应,增加吸光度。解决办法:首先要确认药物是否有吸收,在含有药物的培养基中加入CCK-8,测定450nm的吸光度,如果它的吸光度比不含药物的培养基(加CCK-8)的吸光度高,则证明药物有影响,可在加CCK-8之前更换培养基,去掉药物的影响。
4,每次测定的数值不一样,是什么原因?如何解决?
可能会有以下几个原因:1.当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。2.有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差,建议在加入CCK-8后,轻轻敲击培养板以帮助混匀。3.每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。
5,如何设定空白对照?
在不含细胞的培养基中加入CCK-8,培养一定的时间,测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可在不含细胞,加入药物的培养基中加入CCK-8,培养一定的时间,测定450nm的吸光度作为空白对照。
6,哪些物质会影响CCK8的测定?
当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定,例如含有维生素C的Glucose等(一般培养基中的量不多,酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下,会增加空白吸收,但不影响测定,扣除空白吸收即可。
7,在实验中吸光度值太高,如果不能减少细胞数量,如何解决?
可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如:可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
8,设定参比波长的目的是什么?必须设定吗?
不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。
9,说明书上仅写了96孔板的测定方法,如果使用24孔板或12孔板,应该加多少量CCK-8试剂?
一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。
10,在CCK-8显色过程中,如何终止反应?
有一下几种方法(96孔板):①在显色反应后,将培养板放置4℃冰箱内。②每孔加10μl0.1MHCL溶液。③每孔加10μl的1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。注意:反应停止后,应在24小时之内测定。
11,必须预培养细胞吗?
不一定。如果要向保持细胞的最好状态,建议预培养细胞。如果不做细胞预培养,细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养,但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒
郎格罕斯细胞组织细胞增生症(Langerhanscellhistiocytosis)或郎格罕斯细胞病(Langerhans#39;celldisease)又称组织细胞增生症X(HistiocytosisX),为一组少见的,以郎格罕斯细胞增生为主的疾病.本病的病因和发病机制尚不清楚,有人认为是反应性疾病,而非真性肿瘤.也有人认为本病是免疫系统异常所致,但通过PCNA免疫组化可见较多的阳性细胞,且病变中常见核分裂象故认为是增生性疾病,可能为肿瘤性增生。这种病要看医生。
①持续分裂细胞,又称周期性细胞, 即在细胞周期中连续运转的细胞。机体内某些组织需要不断的更新,组成这些组织的细胞就必须通过不断分裂产生新细胞。此类细胞的分裂周期非常正常, 有丝分裂的活性很高。如性细胞(包括卵母细胞和精原细胞),它们要不断地产生配子; 造血干细胞需要不断地产生红细胞和白细胞;上皮基底层细胞需要通过分裂不断补充表面老化死亡的细胞; 植物的根茎尖端细胞需要通过分裂进行生长等都是具有正常周期的持续分裂细胞。
②终端分化细胞, 即永久性失去了分裂能力的细胞,它们不可逆地脱离了细胞周期, 但保持了生理活性机能。这些细胞都是高度特化的细胞, 如哺乳动物的红细胞、神经细胞、多形性白细胞、肌细胞等, 这些细胞一旦分化,就永远保持这种不分裂状态直到死亡。
③G0细胞,又称休眠细胞,暂时脱离细胞周期,不进行DNA复制和分裂, 也称静止细胞群。但这些细胞可在某些条件的诱导下重新开始DNA合成, 进行细胞分裂。如肝细胞, 外科手术切除部分肝组成后可以诱导进入细胞分裂。淋巴细胞可通过与抗原的相互作用诱导增殖。在胚胎发育早期(卵裂期),所有的细胞均为周期性细胞, 以后随着发育成熟, 某些细胞进入了GO期, 某些细胞分化后丧失分裂能力。到成体时,只有少数细胞处于增殖状态, 它们的增殖仅作为补充丢失的细胞, 或对外界刺激的反应。
由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)引起的结核病是一种古老的慢性传染病,并且至今仍是全球死亡人数最多的单一传染病。据世界卫生组织(WHO)报道:2015年全球有1040万新发结核病患者,有180万人死于结核病。Mtb是一种胞内病原菌,可分泌多种效应蛋白至宿主细胞中,进而干扰细胞信号通路和生物学功能,最终促进病原菌在宿主细胞中的存活并导致宿主细胞病变。中国科学院微生物研究所刘翠华课题组长期致力于研究Mtb等重要病原菌与宿主相互作用的分子机制,近年来先后在NatureImmunology,TheJournalofImmunology等杂志发表系列研究工作,发现了Mtb通过分泌一系列效应蛋白调控宿主细胞功能进而逃逸宿主固有免疫清除的新机制,并揭示了病原菌与宿主间相互博弈的动态过程及分子机制,为抗结核药物研发提供了新思路和特异靶点。
近年来,越来越多的研究表明病原微生物(包括多种病毒和细菌等)感染引起的慢性炎症可增加肿瘤发生发展的危险性,有关感染相关的慢性炎症诱发肿瘤的分子机制研究已成为当前生物医学领域的热点之一。然而,Mtb导致的慢性感染与肺癌的相关性至今尚无定论,关于Mtb效应蛋白在肿瘤发生发展中的分子调控机制更是知之甚少。刘翠华课题组之前的研究表明:Mtb效应蛋白PtpA(一种真核样酪氨酸磷酸酶)可被分泌至宿主细胞中结合泛素分子并被后者激活,进而去磷酸化宿主的p-JNK和p-p38并抑制JNK/p38信号通路的激活;同时PtpA还能以磷酸酶活性非依赖性的方式抑制NF-κB信号通路的激活(NatureImmunology,2015)。进一步的研究发现PtpA的宿主互作蛋白TRIM27(一种泛素连接酶)可作为宿主限制因子抑制分枝杆菌在巨噬细胞内的存活,而PtpA则可通过结合TRIM27蛋白的RING结构域而拮抗TRIM27介导的抗病原菌感染免疫功能(ScientificReports,2016)。最近,该课题组又发现PtpA不仅可在宿主细胞质中调控固有免疫信号通路,还可进入宿主细胞核内(图1)。ChIP-seq分析结果提示:PtpA在宿主细胞核内可调控一系列宿主基因的表达,这些基因主要涉及免疫调控(如TNFRSF8)以及细胞增殖和迁移(如GADD45A)等生物学功能。进一步研究发现PtpA可直接结合至GADD45A基因的启动子区并抑制该基因的转录,并进而促进人非小细胞肺癌A549细胞的增殖和迁移能力及其在裸鼠中的成瘤能力,且该调控功能依赖于PtpA的DNA结合能力而不依赖于其磷酸酶活性。此外,受PtpA调控的宿主细胞核内的潜在靶基因中还包括某些与肿瘤发生发展密切相关的非编码RNA基因(如miR-488、CASC2和miR-622)(图2)。该研究发现了首个可进入宿主细胞核内调控宿主免疫及细胞增殖功能的Mtb效应蛋白PtpA,揭示了Mtb可通过其分泌的效应蛋白在特定情况下促进肺癌发生发展的分子机制。
相关结果已在国际权威期刊NatureCommunications《自然通讯》在线发表,题为“ThemycobacterialphosphatasePtpAregulatestheexpressionofhostgenesandpromotescellproliferation”。刘翠华课题组的助理研究员汪静、研究生葛浦浦为该文章的共同第一作者,刘翠华研究员为该文的通讯作者。该研究得到了国家科技部、国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委和中科院的资助。
文章链接:http://www.nature.com/articles/s41467-017-00279-z.pdf
图1.MtbPtpA可进入宿主细胞核内
图2.宿主细胞核内的MtbPtpA抑制固有免疫功能并促进肿瘤细胞增殖的机制示意图
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