Aninvitromodelofmelanomaenablesoncologistsandcancerresearchersabetterunderstandingofdiseaseprogression,andanefficientplatformfortestingnewtherapies.
Technology:
TheMelanomamodelconsistsofhumanmalignantmelanomacells(A375),normal,human-derivedepidermalkeratinocytes(NHEK)andnormal,human-deriveddermalfibroblasts(NHDF)whichhavebeenculturedtoformamultilayered,highlydifferentiatedepidermiswithmelanomacellsatvariousstagesofCMmalignancy.Atdifferentstagesoftheculture,thetissueexhibitsrADIalgrowthphase(RGP),verticalgrowthphase(VGP),ormetastaticmelanomaphenotype.Thecellsareculturedoncellcultureinsertsusingserumfreemedium,andattainlevelsofdifferentiationonthecuttingedgeofinvitroskintechnology.Structurally,theMelanomamodelcloselyparallelstheprogressionofmelanomainvivo,thusprovidingavaluabletooltostudy,understand,anddeveloppreventativeandtherapeutictreatmentsforoneofthemostseriouscutaneousmalignancies.
TheMelanomamodelexhibitsinvivo-likemorphologicalandgrowthcharacteristicswhichareuniformandhighlyreproducIBLe.Epidermisofthisfullthicknessskinmodelconsistsoforganizedbasal,spinous,granular,andcornifiedepidermallayersanalogoustothosefoundinvivo.Thedermalcompartmentiscomposedofacollagenmatrixcontainingviablenormalhumandermalfibroblasts(NHDF).
TheprotocolsforusingtheMelanomatissuesareclearandstraightforward.MatTek’sMelanomatissueshavebeenutilizedwithanumberoftargetandanti-melanomadrugs.
Figure1.HumanMetastaticMelanomaCells(A375)inFullThicknessMelanomaSkinModel.A375cellsdevelopRGPmelanomanodesatdermal/epidermaljunction(Day11).Withextendedculturetime,melanomanodesadoptaVGPmorphology(Day18)andsubsequentlyisolatedclustersofcellsinvadethedermis(metastaticinvasion)(Day29).Longarrowsindicatemelanomacellclustersattheepidermal-dermaljunction.Shortarrowsshowseparatedmelanomacellclustersinfiltratingthedermis.
Figure2.UltrastructuralanalysisofMelanomaFTSkinModel.
Transmissionelectronmicrograph(TEM)ofthefullthicknessskinmelanomamodel(MLNM-FT-A375).A.Areaofinteractionofmelanomacells(M)andkeratinocytes(KC).B.Areaofinteractionofmelanomacellsandtheunderlyingdermalsubstrate(D).N,nucleus,n,nucleoli.Arrowindicatesapoptoticmelanomacells
Figure3.Fullthicknessskinmelanomamodel(MLNM-FT)containingmetastaticSK-Mel-28cells.S-100antibodystaining.Initiallysmallnestsofmelanomacellsformatthedermal/epidermaljunction(Day11).LaterVGPtumorsdevelop(Day25),andsubsequentlymetastasisintothedermisisobserved(Day29).Longarrowsindicatesomeofthemelanomacellclustersattheepidermal-dermaljunction.Shortarrowsshowindividualmelanomacellsinfiltratingthedermis.
Figure4.ExpressionofN-CadherinAdhesionMoleculeinMLNM-FT-A375FullThicknessMelanomaSkinModel.N-Cadherinantibodystaining,40X.NoteincreasedlevelofN-Cadherinexpressionwithtimeinculture.
Applications:
TumorInvasionandAnti-MelanomaDrugScreening
MatTek’sMelanomatissueexhibitsradialgrowthphase,verticalgrowthphase,andmetastaticmelanomaphenotypes,parallelingtheprogressionofmelanomainvivo.Thismodelprovidesavaluabletoolforoncologistsandcancerresearcherstostudy,understand,anddeveloppreventativeandtherapeutictreatmentsforoneofthemostseriouscutaneousmalignancies.BrowseourMelanomareferencesintheMatTekReferenceLibrarytoseehowdoctorsandresearchershaveusedourMelanomatissue.
TechSpecs:
Tissue:
Kit:Fullthicknessmelanomaskinconstruct(MLNM-FT-A375kit)consistsof24tissues.(Tissue“kits”containtissues,asmallamountofculturemedium,andplasticware;contactMatTekforspecifickitcontents.)
Substrate:Singlewelltissuecultureplateinsertsareused(e.g.MillicellCMsinglewelltissuecultureplateinserts,poresize=0.4µm,surfacearea=0.6cm2).
Culture:Initiallysubmergedandthenattheairliquidinterface.
Histology:Epithelium:8-12epithelialcelllayersplusstratumcorneum(basal,spinous,andgranularlayers);Dermis:Collagengelcontainingfibroblasts.Atearlystagemelanomacellsformnodesatdermal/epidermaljunction.AtlaterstagesmelanomasprogresstoRGP(radialgrowthphase),VGP(verticalgrowthphase)andconsecutivelyinvadedermalcomponent.
Lotnumbers:Tissuelotsproducedeachweekareassignedaspecificlotnumber.Aletterofthealphabetisappendedtotheendofthelotnumbertodifferentiatebetweenindividualkitswithinagivenlotoftissues.Alltissuekitswithinalotareidenticalinregardstocells,medium,handling,cultureconditions,etc.
Shipment:Tissuesareshippedat4°Conmedium-supplemented,agarosegelsin6-wellplates.
Shipmentday:Monday.ShipmentonThursdayalsopossibleuponspecialrequest.
Delivery:TuesdaymorningviaFedExpriorityservice(US).OutsideUS:Tuesday-Thursdaydependingonlocation.
Shelflife:Includingtimeintransit,tissuesmaybestoredat4°Cforupto3dayspriortouse.However,extendedstorageperiodsarenotrecommendedunlessnecessary.Inaddition,thebestreproducibilitywillbeobtainediftissuesareusedconsistentlyonthesameday,e.g.Tuesdayafternoonorfollowingovernightstorageat4°C(Wednesdaymorning).
Lengthofexperiments:Culturescanbecontinuedforupto4weeksformelanomadevelopmentandprogressionwithgoodretentionofnormalepidermalmorphology.CulturesmustbefedeveryotherdayusingMatTekculturestands(MEL-STND;clickonthislinkforphoto)alongwith5.0mlofMLNM-FT-MM.
Alternativetissues:
MLNM-FT-A375(Day6):EarlystageMLNM-FT-A375tissue.TissuehasnotbeenculturedattheAir-LiquidInterface.Customerreceivesrequiredmedia(MLNM-FT-GM)tocontinueculturesandproduceMLNM-FT-A375.DiscussionwithaMatTektechnicalrepresentativeisrequiredpriortoorderingduetoproprietarynatureofthisproduct.Designedforstudyofearlystagesofmelanomadevelopmentinwhichexperimentaldesigndictatesuseofearlystagetissue.
MLNM-FT-EXP:SameasMLMN-FT-A375exceptMatTekreplacesA375cellswithcustomer-suppliedmelanomacells.
Cells:
Type:Humanmelanomacells(A375);Normalhumanepidermalkeratinocytes(NHEK);Normalhumandermalfibroblasts(NHDF).
Derivedfrom:Malignantmelanomacellline(A375);Neonatal-foreskintissue(NHEK);Neonatalskin(NHDF);
Alternatives:HumanmalignantmelanomacellsSK-Mel-28.
Screenedfor:HIV,Hepatitis-B,Hepatitis-C,mycoplasma.
Medium:
Basemedium:MCDB153BasalMedium.
Growthfactors/hormones:Epidermalgrowthfactor,insulin,hydrocortisoneandotherproprietarystimulatorsofepidermaldifferentiation.
Serum:None.
Antibiotics:Gentamicin5µg/ml(10%ofnormalgentamicinlevel).
Anti-fungalagent:AmphotericinB0.25µg/ml.
pHIndicator:Phenolred(0.0012g/l).
Otheradditives:Lipidprecursorsusedtoenhanceepidermalbarrierformation(proprietary).
Assay/Maintenancemedium:MLNM-FT-MMisutilizedforassaysaswellaslongtermmaintenanceoftheMLNM-FT-A375tissues.
QualityControlandSterility:
Visualinspection:Alltissuesarevisuallyinspectedandifphysicalimperfectionsarenoted,tissuesarerejectedforshipment.
End-usetesting:Tissuesfromtheproductionlotareretained,grownforadditional7days,fixedforhistology,andanalyzed.
Sterility:Allmediausedthroughouttheproductionprocessischeckedforsterility.Maintenancemediumisincubatedwithandwithoutantibioticsfor1weekandcheckedforsterility.Theagarosegelfromthe24-wellplateusedforshippingisalsoincubatedfor1weekandcheckedforanysignofcontamination.
Screeningforpathogens:AllcellsarescreenedandarenegativeforHIV,hepatitisBandhepatitisCusingPCR.However,noknowntestmethodcanoffercompleteassurancethatthecellsarepathogenfree.Thus,theseproductsandallhumanderivedproductsshouldbehandledatBSL-2levels(biosafetylevel2)orhigherasrecommendedintheCDC-NIHmanual,“BiosafetyinmicroBIOLOGicalandbiomedicallaboratories,”1998.Forfurtherassistance,pleasecontactyoursiteSafetyOfficerorMatTektechnicalservice.
Notificationoflotfailure:IfatissuelotfailsourQCorsterilitytesting,thecustomerwillbenotifiedandthetissueswillbereplacedwithoutchargewhenappropriate.BecauseourQCandsterilitytestingisdonepost-shipment,notificationwillbemadeassoonaspossible(Undernormalcircumstancessterilityfailureswillbenotifiedwithin8daysofshipment).
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Ki67，在很多肿瘤病理中做，它是判断肿瘤细胞增殖情况的一个指标，越高表示正在肿瘤细胞增殖多，恶性程度越高。P16，是一个抑癌基因，直接作用于细胞周期、抑制细胞分裂的基因，细胞内P16蛋白减少，会引起细胞周期调节紊乱，使细胞无限制增生，甚至癌变。
ki67是什么 Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原,其功能与有丝分裂密切相关,在细胞增殖中是不可缺少 ,但其确切机制尚不清楚. Ki67标记的是处于增殖周期中的细胞。该标记阳性率越高，肿瘤生长越快，组织分化越差，对化疗也越敏感。一般来说，预后较差。
B、癌胚抗原为肠癌组织产生的一种糖蛋白，故可用于癌细胞的检测，B错误；
下、癌细胞表面糖蛋白减少，故可用于检测细胞癌变的证据，下错误；
D、癌细胞的磷脂分子未发生变化，故不能用于检测细胞癌变的证据，D正确．
区别：
1.CCK-8为一瓶溶液，毋需预制，即开即用，MTT法的步骤比较多也比较繁琐。
2.如果药物本身有颜色，那么采用MTT法可以通过离心去除颜色的干扰，多次的离心和吸取上清要求操作者要小心和仔细，否则会降低试验的准确率。
3.CCK-8法生成的甲臜是水溶性的，不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤，因此可以减少一定的误差，其重复性优于MTT。其对悬浮细胞的测定有其独到之处。
4.对细胞毒性小，CCK-8对细胞生长没有影响，测完细胞活性后，去掉含CCK-8的培养基，用新鲜培养基可以继续培养，并且还可以继续做其它指标的检测，而MTT就不能。
5.CCK-8反应时间也短，适合做急性作用。
6.CCK-8线性范围更宽，灵敏度更高。
7.发文章过程中，MTT因其重复性差，一般得不到认可。
应用：
被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
自我复制也叫"自体复制"（self-duplication）．生物体内通过代谢作用，按照原有结构复制成为完全相同的结构的生物合成过程．例如脱氧核糖核酸（DNA)在生物体内以原有的DNA分子为模板,合成两个完全相同的DNA分子的过程.
细胞分裂（cell division）是指活细胞增殖其数量由一个细胞分裂为两个细胞的过程。分裂前的细胞称母细胞，分裂后形成的新细胞称子细胞。通常包括细胞核分裂和细胞质分裂两步。在核分裂过程中母细胞把遗传物质传给子细胞。
比如用CD3、CD28刺激，除了这个还有什么方法吗？增殖！
and还想问问用CD3、CD28刺激是不是所有T细胞都能增殖？
EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。
细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。检测
1.MTT。
MTT法检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan），而死细胞无此功能。用DMSO溶解甲臜后在490nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
MTT法检测细胞增殖算是比较常用的方法了，价格便宜，不过其甲瓒产物不溶于水，需有机溶剂溶解后方可检测，其增加了工作量，同时对结果的准确性产生影响，重复性较差吧。
2.CCK8
CCK8检测原理：CCK8中的主要成分WST®-8能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜，生成甲臜的量与细胞数成正比，可间接测定活细胞数量。
相比较于MTT而言，CCK8的灵敏度要更高，其生成的甲瓒产物溶于水，重复性和准确性上要优于MTT法，对于细胞的毒性较小，不过价格也是相比MTT要贵一截。
3.通过标记DNA检测细胞增殖的常用的大概是Brdu和EDU用的比较多。
Brdu是一种胸腺嘧啶核甘类似物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期）参入正在复制的DNA中，之后我们通过抗Brdu的抗体与荧光二抗快速检测细胞的DNA复制活性。EDU也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中，基于Apollo®荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性，类似于一种化学反应吧，而无需抗原抗体结合。
相比较而言，Brdu或者edu更适合用于siRNA、miRNA、小分子化合物及其药物筛选等。同时Brdu或者EDU也适用于小鼠，大鼠及其他动物模型的各种组织器官(血管除外)的细胞增殖检测。关于Brdu和EDU的各自优缺点可以参考下帖。具体问题具体分析吧，目前来看EDU检测越来越普遍吧。关于Brdu检测细胞增殖，一种可以使用免疫荧光通过Brdu-FITC与DAPI双染判断细胞的增殖情况。
一般对于细胞来说都是免疫荧光的常规步骤吧，只是需要一步盐酸进行变性DNA和中和。
1.细胞铺板24孔板或者6孔板。可以进行加药处理细胞
2.加入一定终溶度的BrdU继续培养一定的时间。随后弃去孔内溶液，PBS润洗3次。
3.4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS再润洗3次
4.0.1％TritonX-100处理细胞15min后，接着PBS润洗3次
4。接着2MHCl处理30min，再加入0.1M的硼酸中和10min，PBS润洗3次。
5.滴加5％BSA室温封闭30min，弃去液体，滴加1:200稀释的BrdU一抗，4℃孵育过夜。
6.次日，弃去一抗，PBS润洗5次，在避光条件下，滴加1:50稀释FITC标记二抗，室温孵育1h后，PBS再润洗5次。
7.pbs洗5遍，滴加DAPI溶液，室温孵育5到10分钟，PBS洗5遍。
8.荧光显微镜观察。拍照。只是需要注意的是细胞固定这一块吧，如果细胞固定不好的话，细胞容易连在一起而无法分清S期和M期等。同时容易造成细胞碎片吧。
附张失败的图片。
文献中完美的图片：
图片来源：EthanolinducescytostasisofcorticalbasalProgenitors
4.关于EDU，目前一般都是拿试剂盒做的，操作简单方便。步骤相比Brdu而言，少了DNA变性，无需抗体孵育等环节。
细胞分裂间期分为G1期S期和G2期 G1期的特点：G1期是从上次细胞增殖周期完成以后开始的。G1期是一个生长期。在这一时期主要进行RNA和蛋白质的生物合成，并且为下阶段S期的DNA合成做准备。如合成各种与DNA复制有关的酶，线粒体、核糖体等都增多了
细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞；同时，多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。
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