第1阶段：影印铺板与工作库的制备

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

羧苄西林（100ug/ml储存溶液）

乙醇（100%)

甘油，45%(体积分数）

LB液体培养基。（1LLB液体培养基含有10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5gNaCl)

超级液体培养基。(1L超级液体培养基含有32g胰蛋白胨、20g酵母提取物、5gNaCl、5ml1mol/LNaOH）

2.生物分子

核对过序列的母系克隆或EST(例如，gf211release，ResearchGenetics)

3.其他仪器

具有水平（吊桶式）转头的离心机，深度6.2cm,可以离心微量滴定板和过滤板（例如，SorvallSuperT21，Sorvall)

AirporeTapeSheets(Qiagen)

Bunsen喷灯

培养箱，预设为37°C

96针接种器（V&PScientific)

深96孔微量滴定板，1.0ml,PP(VWRInternational)

U形底的96孔微量滴定板（Corning)

纸巾

带有深孔板固定装置的振荡培养箱，37°C

带拉链的袋子（zip-lockbag)，1加仑（约4L)

二、方法

1.将密封的母系克隆板在37°C下培养过夜。

2.准备制备克隆系的工作复本：标记96孔圆底（U形底）的微量滴定板，在每一个孔中分装100ulLB液体培养基，含有100ug/ml羧苄西林。
用这些工作复本来保持母系克隆。检验确保这些克隆都具有载体赋予的氨苄西林抗性。

3.在水平式微量滴定板转头中离心母系克隆板，1000r/min离心2min，除去板子封条上的冷凝水。

4.在一个小烧杯中装一些100%乙醇，将96针复制工具在乙醇中浸泡。然后从乙醇中取出工具，并烧接种针。

5.短暂冷却后，将复制工具在母系克隆板中蘸一下，然后转到工作克隆板上。如果必要，每个板子都重复接种一次。

6.将接种后的LB板子盖上盖子，放到装有湿纸巾的1加仑（3.78541dm3)带拉链的袋子中，将袋子密封后，在37C培养过夜。

7.在深孔板的每个孔中，分装1ml含有100ug/ml羧苄西林的超级液体培养基。
这些板子将作为制备模板的培养液的来源。

8.1天后，用复制工具直接从新鲜的LB板中接种至深孔板。

9.用QiagenAirporeTapeSheets将深孔板密封，并在上面盖上塑料盖，在37°C振荡培养箱中以200r/min培养24h。

10.对于要被冷冻（-80°C)作为以后培养源的板子，在每个孔中加入5ul45%(体积分数）的无菌甘油。从剩下的板子中分离质粒模板。

第2阶段：质粒模板的分离

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

乙醇，70%

TlowE缓冲液（10mmol/LTris-HCl，O.lmmol/LEDTA,pH8.0)

2.离心机和转头

具有水平（吊桶式）转头的离心机，深6.2cm,可以离心微量滴定板和过滤板（例如，SorvallSuperT21,Sorvall)

3.专用设备

封板器

涡旋混匀器

4.载体和细菌菌株

从上面第1阶段第9步获得的细菌培养液

&附加试剂

AlkalineLysisMiniprepkit,96孔(EdgeBiosystems)

二、方法

1.将裂解缓冲液（EdgeBiosystemsKit)加热到37°C,使SDS溶解。

2.加入lml的RNA酶溶液至100ml重悬浮缓冲液（EdgeBiosystemsKit)中。在4°C可保存3个月。

3.在EdgeBiosystemsKit接收板的每个孔中，加入350ul细菌培养液。将过滤板放在其顶部，并用带子固定。

4.用装有96孔板转头的离心机，将深孔板中的细菌培养液以1500g离心7min。

5.迅速地在干净的纸巾上将板子颠倒，并轻扣出剩余的培养基。
这一步不要耽搁，否则沉淀会松动，在倒出培养基时可能损失。

6.每个沉淀各加100ul悬浮缓冲液重新悬浮，涡旋混匀，直到所有的沉淀都悬浮起来。
悬浮不充分会造成细胞呈块状，在随后的步骤中不会裂解。

7.在每个孔中加100ul裂解缓冲液，轻轻摇动板子混合lmin,避免使细菌染色体DNA断裂。

8.在每个孔中加100ul沉淀缓冲液，混合1min。

9.在每个孔中加100ul中和缓冲液，并涡旋混匀20s。

10.将深孔板中的混合物转到预先装配好的过滤/接收组装板中。

11.在装有96孔板转头的离心机中，将叠起来的板子以1500g离心12min。

12.取下并弃去过滤板，从接收板中倒出乙醇和滤出液，在干净的纸巾上吸干剩余的乙醇。

13.在每个孔中加入500ul70%乙醇，立即倒出，并在干净的纸巾上吸干剩余的乙醇。

14.除去盖子，将板子放在干净的抽屉中，并用干净的纸巾覆盖，干燥过夜。

15.各加200ulTlowE缓冲液，悬浮每个DNA沉淀，用封板机将板子顶部密封，使沉淀在4°C再水化至少2天。若长期保存，应放在-20°C。

第3阶段：克隆的扩增与PCR产物的评估

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

DEPC处理过的H₂0

TAE缓冲液，1×（40mmol/LTris-乙酸盐，1mmol/LEDTA，pH约8.5)

DNA点样缓冲液（200g/LFicoll400，0.1mol/LNa2EDTA，pH8.0,10g/LSDS，2.5g/L溴酚蓝，2.5g/L二甲苯腈)

dATP溶液，100mmol/L(Pharmacia)

dGTP溶液，100mmol/L(Pharmacia)

dTTP溶液，100mmol/L(Pharmacia)

dCTP溶液，100mmol/L(Pharmacia)

2.酶和酶缓冲液

AmpliTaqDNA聚合酶（Perkin-Elmer)

GeneAmpPCR缓冲液，10X(AppliedBiosystems)

3.核酸和寡核苷酸

载体或基因特异性引物（1mmol/L)

100bpDNAladder(NewEnglandBiolabs)

4.凝胶

球脂糖凝胶（20g/L,TAE缓冲液)

5.专用设备

薄壁PCR板和CyclesealPCR板封板器（RobbinsScientific)

可容纳4个50孔梳子的电泳装置

热循环仪

6.附加器材

琼脂糖凝胶电泳所需的设备和试剂，包括溴化乙锭

1.为每个要扩增的96孔板配制含有以下成分的主体PCR混合液。

PCR缓冲液，10X(含有15mmol/LMgCl₂)1000ul

dATP(100mmol/L)20ul

dGTP(100mmol/L)20ul

dCTP(100mmol/L)20ul

dTTP(100mmol/L)20ul

引物1(lmmol/L)5ul

引物2(lmmol/L)5ul

AmpliTaq聚合酶（5U/ul)100ul

DEPC处理过的H₂08800ul

2.标记好96孔PCR板，在每个孔中分装100ulPCR混合液。
轻扣PCR板，确保没有气泡残留在孔的底部。

3.在每个孔中加入1ul纯化过的质粒模板，并盖好盖子。

4.进行下面的循环反应。



在进行质量对照的凝胶分析时，将板子保存在41°C。

5.通过琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。
凝胶成像只能对产物进行粗略的定量，但可以提供很好的产物组成的特征。

6.从每个孔中取2ul,与2ul点样缓冲液混合。

7.以100bpDNAladder作为标准，在2%琼脂糖凝胶上分析样品。
每个泳道应该显示一条单一的主带，各泳道之间产物的亮度应该相同。

第4阶段：PCR产物的纯化与定置

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

乙醇/乙酸盐混合液(95%乙醇，5%3mol/L乙酸钠，PH6.0)

乙醇，70%

SSC缓冲液，20X(3mol/LNaCl，0.1mol/L柠檬酸钠·2H₂0，用1mol/LHCl，调pH至7.0)

TAE缓冲液，1X(40mmol/LTris-乙酸盐，1mmol/LEDTA，pH约8.5)

DNA点样缓冲液（20%Ficoll400,0.1mol/LNa₂EDTA,pH8.0，10g/LSDS，2.5g/L溴酚蓝，2.5g/L二甲苯腈)

2.离心机和转头

具有水平（吊桶式）转头的离心机，深6.2cm,可以离心微量滴定板和过滤板（例如，SorvallSuperT21，Sorvall)

3.核酸和寡核苷酸

100bpDNAladder(NewEnglandBiolabs)

双链DNA标准样，变化范围是0、50ug/ml、100ug/ml、250ug/ml、500ug/ml

参考双链DNA(0.5ug/ml)(Invitrogen)

4.凝胶

琼脂糖凝胶（20g/L,TAE缓冲液）

5.专用设备

V形底的96孔微量滴定板（Corning)

Immunowash微量滴定板清洗仪（BioRad)

纸巾

可热封的储存袋和热封器

65°C培养箱

可容纳4个50孔梳子的电泳装置

电泳电源

用于荧光检測的96孔板（Dynex)

荧光计（例如，Perkin-ElmerAnalyticalInstruments)

6.附加器材

FluoReporterBluedsDNAQuantitationKit(Molecularprobes)

二、方法

1.在V形底96孔板的每个孔中，加入200ul乙醇/乙酸盐混合液。

2.将每个孔中的100ulPCR产物，转到V形底的板子中，并用75ul移液管吹吸4次混匀。

3.将板子放在-80°C冰箱1h,或者在-20°C保存过夜。

4.将板子解冻以降低其脆性，并溶解孔中可能形成的冰。

5.将板子放入带有微量滴定板转头的离心机中，以2600g、4°C离心40min。

6.用Immunowash微量滴定板清洗仪吸去每个孔中的上清液。
建议在每个孔的底部留约10~20ul,以避免将沉淀搅起。

7.用Immunowash微量滴定板清洗仪在每个孔中加入200ul70%乙醇。

8.以2600g4°C离心40min。

9.用Immunowash微量滴定板清洗仪将每个孔中的上清液吸去。

10.用纸巾将板覆盖，在一个封闭抽屉中干燥过夜。

1.PCR产物的重悬浮

11.在每个孔中，加入40ul3XSSC。用薄片密封器或合适的封条将板子封好，注意要将每个孔都封严。
重新悬浮PCR产物的缓冲液，是由制作微阵列的点样仪和芯片决定的。

12.将板子放在热封的袋子中，里面放有3XSSC浸湿的纸巾。

13.将袋子在65°C培养箱中放置2h,关掉培养箱使板子逐渐冷却。
在培养箱中冷却板子，可以避免封条上产生冷凝水。

14.取1ul重新悬浮的PCR产物，在2%琼脂糖凝胶上分析，如第3阶段中所述。
充分的沉淀和重悬浮，将产生非常亮的条带。

15.装有重悬浮PCR产物的板子，在-20°C保存备用。

2.用荧光测定法对PCR产物定量

16.在荧光测定专用96孔板的每个孔中，加入200ul荧光剂缓冲液（FluoReporterBluedsDNAQuantitationKit)。

17.在荧光测定板的每个孔中，加入1ulPCR产物。

18.在荧光测定板的最后一排，各加1ul双链DNA标准样，分别为0、50ug/ml、100ug/ml、250ug/ml、500ug/mldsDNA。

19.设定荧光计激发光为346nm,发射光为460nm。

20.在0~500ug/ml dsDNA的范围内，测试标准样是否悬线性的，以及是否可重复。

21.从所有对照和其他样品测得的数值中，减去0ug/ml样品的数值后，按照下面的方程
计算PCR产物中dsDNA的浓度。



22.根据上面的计算，对于超出预计印刷浓度范围（0.1~0.5ug/ul)的PCR产物，要调整浓度。

第5阶段：印制微阵列

完成了前面的方案，研究者将会得到制作微阵列所必需的点样材料。印制微阵列的方案参数是由所使用的点样仪和芯片决定的。由于有几种点样仪和芯片的组合可以用来制作微阵列，这里不再给出PCR产物点样的详细方案，可以在其他地方找到（BowtellandSambrook2003)。