一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

ATP(10mmol/L)

dNTP溶液（包含所有4种dNTP,每一种6.25mmol/L)

SDM缓冲液，10X(20mmol/LTris-HCl、pH7.5,8mmol/LMgCl₂，40ug/mlBSA)

2.酶和酶缓冲液

TaqDNA聚合酶

克隆化的PfuDNA聚合酶（Stratagene)

TaqExtenderPCR添加剂（Stratagene)

DpnI限制性内切酶

T4DNA连接酶

3.核酸和寡核苷酸突变引物

模板DNA,dsDNA质粒，小量或大量制备[O.5pmol模板=(0.33ug/kb)X模板大小（kb)]
摸板DNA必须有甲基化的Gm6ATC序列，如果没有，在进行PCR-SDM之前必须在体外用Dam甲基化酶进行甲基化。
只有包含抑菌抗生素抗性基因（如青霉素、四环素和氯霉素）的质粒适用于这个快速方案，也能够使用包含杀菌抗生素抗性基因（如卡那霉素和链霉素）的质粒，但在应用抗生素选择之前必須使被转化的细胞有一个生长的过程。参见第14步的注释。

                                                 突变引物[15pmol引物=(5ng/碱基）X引物大小（碱基）]

在一条或两条引物上有磷酸基团十分重要，这种引物能够被T4多聚核苷酸激酶磷酸化或者直接合成5"末端磷酸基团。

4.培养基

LB琼脂平板（10g细菌培养用酪氨酸，5g细菌培养用酵母提取物，10gNaCl,加H₂0至1L,最终pH7.0,每升加入15g琼脂）

5.特殊设备

FALCON2059管子或替代物

热循环仪

水浴或适当的加热装置，提前设定为37°C、42°C、72°C

温箱，提前设定为37°C

小离心管

6.载体和菌株

E.coli热休克感受态细胞（例如，XLl-blue，Statagene)

7.附加项目

选项：琼脂糖凝胶电泳试剂和装置，包括溴化乙锭(参见步骤9）

二、方法

1.PCR

(1)冰上，在一个已灭菌好的离心管中，混合PCR-SDM反应物。

模板DNA                             0.5pmol

SDM缓冲液，10X                    2.5ul

dNTP溶剂（6.5mmol/L)           1ul

突变引物                             每种15pmol

H₂0                                    补齐至24ul
 
(2)加入2.5U的TaqDNA聚合酶和2.5UTaqExtenderPCR添加剂。
这些酶能够混合在一起，并且能够以1:1(体积比）的混合物形式在-20°C储存至少3个月。

(3)按照如下的PCR条件进行7~12个循环的扩增。


可以根据不同种类的设备和反应体系对时间和溫度作出相应的调整，參见31.2PCR注意事项。
如果热循环仪没有热盖，則要使用矿物油成石蜡来防止在PCR过程中反应混合物的蒸发。

2.消化和拋光PCR-SDM产物

(4)在PCR反应之后，将反应产物放置在冰上冷却2min。

(5)将如下的组分直接加入到25ul扩增产物中。

DpnI限制性内切酶（10U/ul)1ul
PfuDNA聚合酶（2.5U/ul)1ul

如果在循环中使用矿物油覆盖在反应物上，那么在消化、拋光和连接过程中向反应管中加入附加组分的时候，一定要将微量移液器的尖端插入到矿物油层之下。

(6)轻轻混合，然后将反应物置于一个离心管中离心lmin。立即将反应物置于37°C温育30min。

(7)将反应物置于72°C再温育30min。

3.PCR-SDM产物的连接

(8)将下列组分添加到用DpnI和克隆化的PfuDNA聚合酶处理过的产物中。

H₂O                                   100ul

SDM缓冲液，10X                10ul

ATP,10mmol/L             5ul

(9)轻轻混合，然后将反应物罝于一个离心管中离心1min。
可选做：为了证明PCR-SDM产物的完整性，从样品中取出5ul在标准的琼脂糖凝胶电泳中分析。应该能够观察到单一条带。

(10)从上述反应物中取出10ul置于一个已灭菌的离心管中，加入4U的T4DNA连接酶(4U/ul)。

似乎不同批次的T4DNA连接酶对于平端DNA分子的连接能力有相当的不同。这导致了突变效率的变化，在这种方法中，效率变化的范围可以从30%~70%。一旦发现一批质量好的酶，推荐将其保存起来专门用作PCR-SDM。

(11)在37°C将反应物温育1h。

4.转化感受态细胞（快速转化方案）

(12)将热休克感受态细胞在冰上轻轻地解冻，然后取出40ul细胞到一个预冷的FALCOL2059聚丙烯管中。

(13)向细胞中加入1ul连接酶处理过的DNA，轻柔地搅拌，在冰上放置30min。

(14)在42°C热激30s，然后在冰上放置2min。
已经针对FALCON2059管优化过热激的条件了，如果采用不同的管，反应条件应该重新做相应的优化。
如果使用的质粒包含有杀菌型抗生素抗性基因，在冰上放置2min后，需要添加260ulLB,在37°C、250r/min的条件下摇动30min,然后继续第15步操作。

(15)立即将所有体积的感受态细胞放置到包含有适当选择性抗生素的LB琼脂平板上涂板。将平板在37°C放置过夜。