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步骤：1RNA抽提（同RT）
2逆转录使用合oligo
3p内参
4使用根据已知序列设计游引物提供游引物做PCR注意设计游引物退火温度与游引物相差
5产物切胶收TA克隆测序

oligo游引物我根据TakaraBD公司manual自设计经我使用效具体操作参照takara3－racemanual先做3－race解熟悉功再做5－race5－race要买试剂盒做较复杂

少于10条．我要辩论需要些资料我反．给我答案详细点．谢谢

请教各位大虾，最近我想克隆一个大约2.5kb的CDNA，但是由于实验室没有在酵母菌中做过类似试验，所以不知道该怎么入手，一些特别要注意的问题也不太清楚。还有就是不知道那里有专门提供酵母菌的cDNA克隆的公司。如果有这样的公司就可以直接购买了，可以省好多事。希望大家多多帮忙。谢谢！

想要通过克隆基因的方法了解一个基因的功能，如何设计引物呢？

我刚考上硕士，导师就让我克隆一个基因，可我啥也不会，怎么办？
我已经知道了这个基因在其他物种中的序列和它所编码的蛋白质的序列，导师的意思是让我把它在大豆中克隆出来。我该怎么办？
听导师说，可能要用到RT-PCR。谁能帮帮我？
感激不尽啊！

基克隆即重组DNA技术,指体外DNA按照既定目案,采用酶同源DNA体外剪切重新连接,组装新DNA.基础,DNA导入定宿主细胞,使能够宿主细胞扩增,形量代,程即称基克隆.基克隆包括四基本技术环节:

选择目基,并设计相应引物；
　　用引物PCR扩增目基片段；
　　选择合适（抗性标记、酶切位点等）克隆载体（保真扩增）,并PCR片段连接入克隆载体；（般用Taq酶PCR产物末尾自带A,Solution 1作用与两端各带T线性T载体直接相连）
　　连接产物转化入受态肠杆菌,使含抗素培养基扩增；
　　肠杆菌提取质粒（即前面连接产物）,酶切鉴定测序鉴定均误目基片段切并与新表达载体连接,再转化入肠杆菌扩增,再提质粒,即想要目基片段克隆.

基克隆需要烟草内验证功能
基克隆利用体外重组技术,特定基其DNA顺序插入载体基克隆主要目标识别、离特异基并获基完整 全序列,确定染色体定位,阐明基化功能,明确其特定性状遗传控制关系通几十努力由于植物发育,理化,遗传等科迅速发展,使 掌握量关植物优良性状基物遗传知识,再运用先进酶物技术已经克隆与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质 及与植物发育关许基我实验室麻抗真菌蛋白基作功能克隆研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),克隆植物基探讨 其克隆,本文论述基克隆策略、及取些进展
1　功能克隆(functional Cloning)
功能克 隆根据性状基本化特性功能信息,鉴定已知基功能克隆(Collis,1995)其具体作:纯化相应编码蛋白构建 cDNA文库或基组文库,DNA文库基筛选根据情况主要用二种办进行,(1)纯化蛋白质进行氨基酸测序,据合寡核苷酸探针cDNA 库或基组文库筛选编码基,(2)相应编码蛋白制相应抗体探针,cDNA入载体表达库筛选相应克隆功能克隆种经典基克隆策略, 基离利用种策略
Hain等葡萄克隆两编码白藜芦醇合二苯乙烯合酶基(Vst1Vst2),葡萄抗菌化合 物白藜芦醇存,提高灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)抗性,烟草其些植物二苯乙烯合酶,克隆该基经转基,些植物产灰质葡萄孢抗性意义(Hain 等,1985)Kondo等1989编码水稻巯基蛋白酶抑制剂基组DNA做克隆序列析(Kondo等,1989)周兆斓等构建水稻 cDNA文库,离编码水稻巯基蛋白酶抑制剂cDNA(周兆斓等,1996)植物蛋白酶抑制剂类抗虫物质,抑制摄食害虫蛋白质消 化,使害虫缺乏所需氨基酸导致非发育或死亡胡华等烟草离流行于我黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆编码该病毒外壳蛋白cDNA基(胡华等,1989)王春香等病烟草叶片离纯化马铃薯x病毒 (potato virus X, pvx),克隆完整马铃薯x病毒外壳蛋白基,并外壳蛋白基转入马铃薯,期获抗pvx病毒栽培种马铃薯(王春香等,1991)病毒外壳 蛋白(Coat protein cp)基功克隆,使转基植物产病毒外壳蛋白基介导抗性(Coat Protein Mediated Resistance CPMR)或病毒CP-RNA介导抗性Van kan 报道真菌功克隆毒基Avr9,直接利用基介导广谱高效基工程植物(Van Kan等,1991)我1995构建麻cDNA文库,制备抗体探针功离编码麻抗真菌蛋白基cDNA克隆,抗真菌基农业、医 药等面应用打基础(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997)功能克隆特点用基表达产物蛋白质克隆基、虽某性状编码基未 知其理化及代谢途径研究比较清楚,离纯化控制该性状蛋白质功能克隆关键离纯度高蛋白质要纯 蛋白质,十特异探针,策略行效采用功能克隆虽已经克隆基,由于绝数基产物目前知道所数基 难用经典克隆随着物技术发展,条新基克隆策略逐渐形,定位克隆
2　定位克隆(Positional cloning)
根据遗传连锁析,染色体步移基定位染色体具体位置断缩筛选区域进克隆该基,研究该基功能或抗性化机制,种策略 叫定位克隆(Monaco,1994)连锁析即通基与DNA标记间重组系数估计两者间距离,若某种性状基与DNA标记代 离,即连锁起趋势根据原理与已知某DNA标记连锁基染色体定位由于连锁析需要依赖特定基作连锁标记,即标记基 与待研基间存连锁关系,满足与待研基相连锁基实太少,所连锁析克隆数基存着定困难RFLP现使态性基标记存 于整基组内,解决连锁析难克服困难
1980Wyman等科家首建立限制酶切片段度态性RFLP (restriction fragment length polymorphism),使任何种表型相关基定位能限制酶切片段度态性用限制性内切酶切割产DNA片段度态性呈 孟德尔式遗传,存于全基组独特态标记,RFLP使基定位变易行(Wyman等,1980)目前定位克隆般用RFLP等标记制作 遗传图谱,寻找与待测基连锁RFLP标记,获基染色体定位克隆基所RFLP发展起RAPD技术建立,待测基相 准确定位,利用已知基离与连锁未知基其基本程序构建基组文库、用已知A基探针,基组文库筛选与其同源序列 a克隆,再用a克隆探针基组文库筛选与a克隆同源序列b克隆,类推筛选未知基并离目前已番茄、烟草、麦、 水稻、豆、玉米等植物发现与抗病基紧密连锁RFLP标记并构建遗传图谱(Figdore等,1988;Heun等,1991;Smith, 1991;Diers等,1992)用种已别克隆拟南芥菜、番茄、水稻等植物关抗病基(Martin等,1993;Bent等, 1994;Mindrinos等,1994;Wenyuan等,1995) Martin等1993早用定位克隆技术克隆番茄pto基,pto基负责带毒基Avrpto细菌,丁香假单胞菌 (pseudomonas syringae pv)菌株抗性,Pto基导入病番茄转基植株增强病原菌抗性(Martin等,1993)Wenyuan等1995用技术克隆 水稻Xa21基,Xa21基真菌Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo)具抗性(Wenyuan等,1995)

请以下列格式列出
机构：
负责人：
研究方向：如血液病，生育遗传咨询等
成绩：

非常感谢！

tair网站

本人是个菜鸟、设计引物时忘记考虑目的片断大小了！引物已经合成了、才发现克隆基因目的片断大小为180bp左右、是兼并引物来克隆未知基因片断、再做全基因克隆。向大家请教一下，这样做可行吗？是不是片断太小？？？老板还不知道、估计要废废了。恳请大家多多指教。有没有什么补救的办法？好的建议？？？？？

DNA拓扑异构酶催化反应
很多，其反应本质是先切断DNA的磷酸二脂键，改变DNA的链环数之后再连接之，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能．然而它们并不能连接事先已经存在的断裂DNA，也就是说，其断裂反应与连接反应是相互耦联的。拓扑异构酶（包括Ⅰ型和II型）都可以用符号转化模型进行解释（下图左中）
除了DNA拓扑异构酶可以产生异构变化以外，很多能够嵌入相邻碱基之间影响碱基堆集作用的试剂，特别是片状的染料分子．也能改变DNA的拓扑状态，最明显的例子就是溴化乙锭(ethidium bromide)。例如以SV40的CCC分子与溴化乙锭的结合试验为例，当没有染料时，此DNA为负超螺旋，具有较高的沉降常数(21S)；当加入染料分子与核苷酸之比为0.05时，沉降数降至l6S，此时DNA为没有超螺旋的松弛形式；当染料分子和核苷酸的比值增加到0.09时，沉降常数又上升到大约21S，此时DNA分子为正超螺旋。这种关系如上图右所示，不过要注意的是，溴化乙锭并没有改变Lk值，只不过是由溴化乙锭分子的嵌入，增加了局部DNA二级结构的紧缠状态。因而，随着嵌入染料分子数的增多，起初表现为负超螺旋的减少与消失，随后便是正超螺旋的增加。这与单链DNA结合蛋白促进负超螺旋转变为泡状结构的情况是类似的。
拓扑异构酶（topoisomerase）:通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二酯键，然后重新缠绕和封口来改变DNA连环数的酶。DNA促旋酶。
DNA拓扑异构酶 DNA topoisomerase
为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称。催化DNA链断开和结合的偶联反应，为了分析体外反应机制，用环状DNA为底物。在闭环状双链DNA的拓扑学转变中，要暂时的将DNA的一个链或两个链切断，根据异构体化的方式而分为二个型。切断一个链而改变拓扑结构的称为Ⅰ型拓扑异构酶（top- oisomeraseⅠ），通过切断二个链来进行的称为Ⅱ型拓扑异构酶（topoisomeraseⅡ）。属于Ⅰ型的拓扑异构酶，有大肠杆菌的ω蛋白（ω-protein，由分子量11万的单个多肽链所成）及各种真核细胞中存在的切断-结合酶（nicking-closing enzyme，分子量约6万5千—7万的及分子量约10万的）。Ⅱ型拓扑异构酶，有存在于细菌中的DNA促旋酶、噬菌体T4的拓扑异构酶Ⅱ以及真核细胞中依赖ATP的拓扑异构酶Ⅱ等。另外，噬菌体λ的irt基因产物和噬菌体φX174的基因A的产物等也具有切断—结合酶的活性，可认为是拓扑异构酶之一种。Ⅰ型拓扑异构酶不需要ATP的能量而催化异构体化，作为反应的中间产物，在原核生物来说是游离型的5′-OH末端扣3′-磷酸末端与酶形成共价键，而真核生物是3′-OH末端5′-磷酸末端与酶形成共价键。此酯键中所贮存的能量，可能在切断端的再结合上起着作用。Ⅰ型拓扑异构化酶催化的反应有下列各种：使超螺旋DNA在每一切断—结合反应中，使L数（参见DNA拓扑学异构体）发生一种变化，即松弛（relaxation）（图1）。将互补的单链环状DNA转变成具有螺旋结构的双链环状DNA（图 2），使单链DNA打结（topological knot）或解结（图3）。另外在二个环状双链DNA一个分子的一个链切断时，形成链环状二聚体的分子（ca-tenane）。在Ⅱ型拓扑异构酶中，DNA促旋酶可单独催化闭环状DNA产生超螺旋，这是独特的。其它二个型的酶，除可使超螺旋松弛也需要ATP的能量外，还可催化促旋酶的催化反应。真核细胞的拓扑异构酶Ⅰ，参与核小体的形成，细菌的ω蛋白参与转录和某种转位子的插入。促旋酶和T4拓扑异构酶Ⅱ参与DNA的复制和转录过程。　DNA 拓扑异构酶 I （DNA Topoisomerase I）催化4种反应：①超螺旋的松弛；②绳结(knot)的形成；③环状双链分子的形成；④环状双链分子的连接。本酶由于来源于小牛胸腺，与来源于原核生物的酶性质不同，即使在Mg2+不存在的条件下也显示活性。而且，原核生物由来的DNA Topoisomerase I 只作用负链的超螺旋分子，而本酶则能使正负两方的超螺旋分子均形成松散型。向左转|向右转