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2021-07-30
DNA甲基化是一种表观遗传修饰,它是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase, Dnmt)催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(mC)的一种反应,在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。 查看更多
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2021-08-24
当有大量的样本,多个微卫星标记需要分型时,需要本单元描述的分型方法。例如,用全基因缉的方法做一个疾病的连锁分析研究,需要在 500 个个体里检测 300 个标记,这样就要 150000 次基因分型。本单元描述的技术是用 Perkin-Elmer 的自动 DAN 测序系统,但也可以修改用于其他的自动荧光测序系统。 查看更多
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2018-08-06
该方案中,用 PCR 分析由质粒载体编码的随机多肽文库。该文库是由连接反应的产物转化细菌后得到的,方案 2 已经介绍过,然后再用标准的程序对质粒进行扩增和纯化。本实验来源于 PCR 实验指南(第二版),作者:种康,瞿礼嘉。 查看更多
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2018-08-06
PCR可用以指数扩增位于两个特定引物杂交位点之间的DNA片段,而在连接介导 的单侧PCR中,本质上,它只需要一个引物杂交位点的特异性,第二个引物是通过连 接反应加上的单一接头。这个接头和旁侧的基因特异性引物一起可以对任 何DNA片段进行指数级的扩增。由于一个确定的已知长度的序.列被加于每个片段,可以完整地扩增一些复杂的DNA群体,如分辨率达到单碱基水平的序列梯。来源:《精编分子生物学实验指南》第五版 查看更多
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2021-09-18
父子关系的分子分析实验的相关实验步骤、实验技巧、实验protocol、实验经验及常见问题。 查看更多
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2018-12-26
在质粒载体中进行平末端片段的克隆 1.分别设立两个反应,用适当的限制性内切核酸酶消化1~10μg质粒DNA和外源DNA片段,使它们能产生平末端。2.苯酚:氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源DNA片段。3.分别用TE(pH 8.0)重新溶解纯化出的两种DNA沉淀,使终浓度为100 ng/ml。 假设1 bp 查看更多
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2021-09-20
本方案设计为 24 个 PCR 反应,使用 3 种 cDNA 亚群(利用方案 3 中的 H-T11M 引物进行 RT 反应),引物为荧光染料标记的锚定引物(FH-T11M) 与 24 种上游任意引物 (HAP) 的组合。本实验来源于 PCR 实验指南(第二版),作者:种康,瞿礼嘉。 查看更多
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2018-08-06
常用的核酸电泳法有两种。 查看更多
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2021-08-29
大引物方法最初是由 KAMMANN 等人(1989)建立的,现在的方法是经过许多研究人员包括 Sarkat 和 Sommer (1990,1992), Giebel 和 Spritz(1990),Landt 等(1990),Marini 等(1993), Picard 等(1994),Ling 和 Robinson(1997) 等人修改后产生的基于 PCR 诱变的最简单、成本低廉的方法。本实验来源于分子克隆实验指南(第三版)下册,作者:〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。 查看更多
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2021-07-27
用 PCR 分析酵母菌落时,无需纯化 DNA。本方案以单个酵母菌落的粗裂解液作为 PCR 扩增的模板,来确定 YAC 中是否携带目的 DNA 序列。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。 查看更多
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2018-08-07
尽管整合性转化的频率很低,但可以通过与整合位点同源的克隆化基因内的限制性位点将质粒线性化以提高转化效率。得到的整合体含有完整的质粒,两侧为基因的完整拷贝。 查看更多
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2021-08-16
部分分解多肽氨基酸序列 20 个左右残基长度,用编码多肽两端的 PCR 引物进行 PCR 反应,能够检测 PCR 产物的长度,用此法得到的 cDNA 只有几十个碱基对,但它将成为后续筛选基因的重要突破口。 查看更多
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WB试验常见问题解答123
yawenjilin2021-07-28
我现在要用bac克隆自己标记成探针做人类染色体水平的fish,以确定染色体的具体断裂位置。
现在已经把bac克隆的质粒DNA提取出来了,但是在标记探针前,有以下几个疑问:
1:提取出的质粒DNA是否需要通过测序等方法进行验证该克隆的准确性?
2:是否需要把bac克隆的DNA从载体上酶切下来?如果酶切,UCSC数据库中提供的两侧序列末端的酶切位点就是吗?如果不用酶切,那载体片断在探针标记时会不会一同标记上从而影响后续试验结果?
3:在探针标记前,酶切或不酶切得到的bac克隆DNA是否需要进一步纯化?用普通的琼脂糖电泳切胶回收纯化就可以吗?那所用的切胶回收试剂盒应该是哪种的呀?
4:像我这种自己标记好探针,在作fish时,有现成的试剂盒吗?
第一次做fish,有好多不是很清楚的地方,查阅大量文献中也只是提供其中几个关键步骤,希望有经验的朋友提供宝贵意见,给与指导。
非常感谢!!!
现在已经把bac克隆的质粒DNA提取出来了,但是在标记探针前,有以下几个疑问:
1:提取出的质粒DNA是否需要通过测序等方法进行验证该克隆的准确性?
2:是否需要把bac克隆的DNA从载体上酶切下来?如果酶切,UCSC数据库中提供的两侧序列末端的酶切位点就是吗?如果不用酶切,那载体片断在探针标记时会不会一同标记上从而影响后续试验结果?
3:在探针标记前,酶切或不酶切得到的bac克隆DNA是否需要进一步纯化?用普通的琼脂糖电泳切胶回收纯化就可以吗?那所用的切胶回收试剂盒应该是哪种的呀?
4:像我这种自己标记好探针,在作fish时,有现成的试剂盒吗?
第一次做fish,有好多不是很清楚的地方,查阅大量文献中也只是提供其中几个关键步骤,希望有经验的朋友提供宝贵意见,给与指导。
非常感谢!!!
【求助】有人做DNA拓扑异构酶Ⅰ的吗 PCR技术讨论版论坛123
zhangbo71172021-08-13
请问,有人做DNA拓扑异构酶Ⅰ的吗?不知哪个实验室可以提供一些,谢谢。
一个基因没有克隆到全长序列可以做实时定量分析吗 分子生物 ...123
村里那点事TA停2017-11-07
便宜找找别没直接问别要合每碱基1块钱左右吧
编码DNA结合蛋白的cDNA克隆的检测、纯化和鉴定实验 实验方法 ...123
小锋4912021-08-29
难需要看蛋白纯化工艺DNA处理
举例言目前家药典条宿主DNA残留检测
举例言目前家药典条宿主DNA残留检测
不知道基因全长的话基因克隆有什么作用123
宁宁3QW812021-07-27
步骤:1RNA抽提(同RT)
2逆转录使用合oligo
3p内参
4使用根据已知序列设计游引物提供游引物做PCR注意设计游引物退火温度与游引物相差
5产物切胶收TA克隆测序
oligo游引物我根据TakaraBD公司manual自设计经我使用效具体操作参照takara3-racemanual先做3-race解熟悉功再做5-race5-race要买试剂盒做较复杂
2逆转录使用合oligo
3p内参
4使用根据已知序列设计游引物提供游引物做PCR注意设计游引物退火温度与游引物相差
5产物切胶收TA克隆测序
oligo游引物我根据TakaraBD公司manual自设计经我使用效具体操作参照takara3-racemanual先做3-race解熟悉功再做5-race5-race要买试剂盒做较复杂
【求助】我这样克隆基因是否可以写进文章中 PCR技术讨论版...123
实验狂人20132013-12-10
功能基因的克隆及生物信息学分析123
牛阿乾afFB392021-07-24
基克隆70代发展起项具革命性研究技术概括∶、切、连、转、选终目于通相应技术手段目基导入寄主细胞宿主细胞内目基量复制
"切"指用序列特异限制性内切酶切载体DNA或者切目基;"连"指用DNA连接酶目DNA同载体DNA连接起形重组DNA;"转"指通特殊重组DNA送入宿主细胞进行复制扩增;"选"则宿主群体挑选携带重组DNA体基工程技术两基本特点水平操作细胞水平表达水平操作即体外重组程实际利用工具酶DNA进行"外科手术"
"切"指用序列特异限制性内切酶切载体DNA或者切目基;"连"指用DNA连接酶目DNA同载体DNA连接起形重组DNA;"转"指通特殊重组DNA送入宿主细胞进行复制扩增;"选"则宿主群体挑选携带重组DNA体基工程技术两基本特点水平操作细胞水平表达水平操作即体外重组程实际利用工具酶DNA进行"外科手术"
RNA干扰的作用机制及小干扰RNA的合成方法 123
TD哥哥34972017-11-01
许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高,定制周期长,特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高,为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究。
不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素。 以DNA Oligo为模版,通过体外转录合成siRNAs,成本相对化学合成法而言比较低,而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小,稳定性好,效率高,只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果,从而使转染效率更高。
最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。
不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。长期研究。
用RNase Ⅲ 消化长片断双链RNA制备siRNA
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ,然后用RNase Ⅲ (or Dicer) 在体外消化,得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后,这个siRNA混合物就可以直接转染细胞,方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤,为研究人员节省时间和金钱(注意:通常用RNAse Ⅲ通常比用Dicer要便宜)。不过这种方法的缺点也很明显,就是有可能引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
最适用于:快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
不适用于:长时间的研究项目,或者是需要一个特定的siRNA进行研究,特别是基因治疗 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶Ⅲ启动子(pol Ⅲ)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol Ⅲ启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol Ⅲ 启动子下游。由于涉及到克隆,这个过程需要几周甚至数月的时间,同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。
最适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)。 siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,包括一个RNA pol Ⅲ启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol Ⅲ终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是,SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤,可以直接由PCR得到,不用一天的时间。因此,SECs成为筛选siRNA的最有效工具,甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点,那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中(晶赛公司的Protocol可以解决这一问题)②不能进行序列测定,PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。
最适用于:筛选siRNA序列,在克隆到载体前筛选最佳启动子
不适用于:长期抑制研究。(如果克隆到载体后就可以了)向左转|向右转
最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究。
不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素。 以DNA Oligo为模版,通过体外转录合成siRNAs,成本相对化学合成法而言比较低,而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小,稳定性好,效率高,只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果,从而使转染效率更高。
最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。
不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。长期研究。
用RNase Ⅲ 消化长片断双链RNA制备siRNA
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ,然后用RNase Ⅲ (or Dicer) 在体外消化,得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后,这个siRNA混合物就可以直接转染细胞,方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤,为研究人员节省时间和金钱(注意:通常用RNAse Ⅲ通常比用Dicer要便宜)。不过这种方法的缺点也很明显,就是有可能引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
最适用于:快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
不适用于:长时间的研究项目,或者是需要一个特定的siRNA进行研究,特别是基因治疗 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶Ⅲ启动子(pol Ⅲ)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol Ⅲ启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol Ⅲ 启动子下游。由于涉及到克隆,这个过程需要几周甚至数月的时间,同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。
最适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)。 siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,包括一个RNA pol Ⅲ启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol Ⅲ终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是,SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤,可以直接由PCR得到,不用一天的时间。因此,SECs成为筛选siRNA的最有效工具,甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点,那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中(晶赛公司的Protocol可以解决这一问题)②不能进行序列测定,PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。
最适用于:筛选siRNA序列,在克隆到载体前筛选最佳启动子
不适用于:长期抑制研究。(如果克隆到载体后就可以了)向左转|向右转
【求助】FISH求助 细胞技术讨论版论坛123
zbzlz2021-08-23
我想了解一下fish的含义,具体操作如何。请各位行家帮忙,谢谢!
【求助/交流】求助基因克隆方面的问题解决方案 微生物 综合其他 ...123
kflame1232008-03-31
我想克隆山羊的一个基因,可是在NCBI上只找到小鼠的序列,请教一下大家该怎么做,尽量说的详细一点,谢谢了
[原创] Western blot转膜整个过程 123
苦丁奶茶2021-08-31
听说种找相近物种该基全序列做比找内含位置再设计引物内含区域测序没用种能能说具体操作选物种用软件比较序列
酵母菌基因克隆实验 实验方法123
victory8111112021-08-28
请教各位大虾,最近我想克隆一个大约2.5kb的CDNA,但是由于实验室没有在酵母菌中做过类似试验,所以不知道该怎么入手,一些特别要注意的问题也不太清楚。还有就是不知道那里有专门提供酵母菌的cDNA克隆的公司。如果有这样的公司就可以直接购买了,可以省好多事。希望大家多多帮忙。谢谢!

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