实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1.消化细胞总RNA或poly（A）^＋RNA中的DNA：

50ugRNA

10ul1U/ul人胎盘RNase抑制剂

1/ul10U/ul无RNase的DNaseI

5ul0.1mol/LTris·Cl，pH8.3

5ul0.5mol/LKCl

5ul15mmol/LMgCl₂

加水到50ul

37℃温育30min。

2.加入50ul酚/氯仿（3：1），涡旋混勻，最高速离心2min分相。

3.转移上层到一个干净的微量离心管中，加入5ul3mol/L的乙酸铵和200ul100％乙醇。-70℃放置30min沉淀RNA。

4.高速离心10min。去除上清，用500ul70％的乙醇洗涤沉淀（沉淀的RNA）。

5.溶解RNA沉淀于20ulDEPC处理水，用分光光度计测量A₂₆₀准确定量RNA的浓度。

6.用琼脂糖/甲醛凝胶电泳分析3ug用作差异显示分析的RNA，检査RNA的完整性。无DNA的RNA保存在-80℃直到做差异显示分析。

7.对于每一个RNA样品，标记4个微量离心管为G、A、T和C个管子对应一个简并锚定oligo（dT）引物。

8.把1ug无DNA的RNA（步骤5）稀释到0.1ug/ul，置于冰上。

9.用4个不同的简并锚定引物（5"-T₁₂MN-3"；T₁₂MG、T₁₂MA、T₁₂MT、T₁₂MC，M是G、A或C）配制无DNA的总RNA或poly（A）^＋RNA的逆转录反应：

4ul5×MoMuLV逆转录酶缓冲液（终浓度1×）

2ul0.1mol/LDTT（终浓度10mmol/L）

1.6ul250umol/L4dNTP混合物（终浓度250mmol/L）

0.2ug总RNA或0.1ugpoly（A）^＋RNA

2ul一个10umol/L简并锚定oligo（dT）引物（T₁₂MN；终浓度1umol/L）

DEPC处理水调整体积到19ul。

10.65℃温育5min变性mRNA的二级结构，继续37℃温育10min复性引物。

11.每管加入1ul200U/ul的MoMuLV逆转录酶，混匀，37℃温育50min。

12.95℃加热5min，灭活逆转录酶，高速离心把溶液收集到管底。把管子放在冰上马上准备PCR，或保存在-20℃以备日后使用（可以稳定保存至少6个月）。

13.为每个引物准备如下20ul的反应混合液：

10ulH₂O

2ul10×扩增缓冲液（终浓度1×）

1.6ul25umol/L4dNTP混合物（终浓度2umol/L）

0.2ul［α-³³P］dATP

2ul12umol/L的随机十聚体（终浓度0.2umol/L）

2ul10umol/L的简并锚定oligo（dT）引物（T₁₂MN；终浓度1mmol/L）

2ulCDNA（12步）

0.25U5U/ulTaqDNA聚合酶

14.上下吹吸混勻，覆盖25ml矿物油。

15.在热循环仪上用如下程序扩增：

40轮：

30s94℃（变性）

2min40℃（复性）

30s72℃（延伸）

1轮：

5min72℃（延伸）

最后一步：4C（保持）

16.混合3.5ulPCR产物和2ul甲酰胺上样缓冲液，80℃加热2min。上样到6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上。60W电泳约3h直到二甲苯青走到离底部10cm以内。

17.小心移去凝胶上的一块玻璃板。把一张Whatman3MM滤纸覆盖在凝胶上，在凝胶和滤纸之间不要留有气泡。不需要在甲醇/乙酸中固定，室温干凝胶约1h。

18.使用放射性墨水或钟头打孔器标记X射线胶片和干好的凝胶移确定它们的方向。室温曝光24～48h。

19.洗片，把凝胶片和凝胶比照，标出感兴趣的DNA条带（在不同泳道差异显示的条带）或用一支干净的铅笔或割穿凝胶片在凝胶片下作标记。

20.用刀片割出凝胶块和黏附其上的Whatman3MM滤纸，放人一个微量离心管。加入100ulH₂O，室温浸泡10min。

21.盖上管子煮沸15min。

22.高速离心两分钟沉淀凝胶块和滤纸残渣。转移上清到一个干净的管子里。

23.上清中加入10ul3mol/L的乙酸钠（终浓度0.3mol/L）和5ul10mg/ml的糖原（作为载体）。加入400ul100％的乙醇，-70℃放置30min。4℃高速离心10min。

24.用500ul85％的乙醇洗涤沉淀，晾干，重新溶解于10ulH₂O中。

25.在一个40ul的反应体积里再次扩增4ul洗脱的DNA。使用和步骤13～15中同样的简并描定引物和PCR条件，不同的是加入250umol/L4dNTP混合物（终浓度20umol/L）代替1.6ul25umol/L4dNTP混合物，也不加同位素。-20℃保存剩余的回收DNA以备将来扩增（可稳定数年）。

26.取每个PCR样品30ul在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，用0.5ug/ml的EB染色。20℃保存剩余的PCR样品（可以稳定保存数年）。

27.从琼脂糖凝胶上抽提所希望扩增的DNA条带。用它作探针进行North-era印迹分析和cDNA库的筛选。

28.亚克隆，测序鉴定余下的PCR样品。