...实验:脉冲场凝胶电泳制备DNA(酵母完整DNA的分离) 实验方法 丁 ...
| 实验方法原理 | 制备用于电泳的酵母DNA，先用酶破坏酵母细胞胞壁，然后在熔化的低熔点琼脂糖中混悬，制成栓。将栓浸入含蛋白酶的裂解缓冲液，以加速细胞裂解和除去蛋白质。此方法在Schwartz和Cantor(1984)最初介绍的方法上略有改进，它可用于制备作为高分子质量标准的酵母染色体和酵母人工染色体（YAC)。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 酵母混悬培养物 试剂、试剂盒 | 细胞清洗缓冲液EDTAL缓冲液TE酵母裂解缓冲液酵母细胞壁消化酶酶解酶 仪器、耗材 | 低熔点琼脂糖SorvallGSA转头或相当型号的转头预成型的Plexiglas模具 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 细胞清洗缓冲液（0.01mol/LTris-Cl(pH7.6)，0.05mol/LEDTA(pH8.0)，室温存放。） EDTA(0.05mol/L,pH8.0) L缓冲液（0.1mol/LEDTA(pH8.0)，0.01mol/LTris-Cl(pH7.6)，0.02mol/LNaCl，4℃存放） 含蛋白酶K和十二烷基肌氨酸钠（Sarkosyl)的L缓冲液 TE（pH7.6） 含40μg/mlPMSF的TE（pH7.6） 酵母裂解缓冲液（0.01mol/LTris-Cl（pH7.6），0.5mol/LEDTA（pH8.0），β-巯基乙醇（1%V/V）） 酵母细胞壁消化酶 酶解酶（Zymolyase）5000（KirinBreweries）或溶细胞酶（Lyticase）（67mg/ml）（Sigma） 2.凝胶 低熔点琼脂糖（1%） 3.离心机和转头 SorvallGSA转头或相当型号的转头 4.专用设备 预成型的Plexiglas模具（50~100μl，Pharmacia或Bio-Rad),或一个长的Tygon管（1/8英寸或内径3.2mm),或一个塑料注射器（1ml）。 5.细胞和组织 酵母混悬培养物 二、方法 1.3000g(SorvallGSA转头4300r/min)4℃离心5min收集混悬培养的酵母细胞。用细胞清洗缓冲液洗两次细胞沉淀。 2.混悬细胞于0℃的0.05mol/LEDTA（pH8.0）中，浓度3X109个细胞/ml。 3.用L缓冲液配制1%低熔点琼脂糖。熔化后，冷却至42℃。 4.加75μl酶解酶或溶细胞酶溶液到步骤2的细胞混悬液内，混匀。 5.加热细胞混悬液至42℃。将5ml熔化的琼脂糖和5ml细胞混悬液混合。用一个封口的巴斯德吸管搅匀混合物，以保证细胞完全分散在琼脂糖中。 6.混合物移入预成形的Plexiglas模具（50~100μl，Pharmacia或Bio-Rad),或吸混合物到合适长度的Tyson管（内径3/32英寸）内，也可以吸入1ml塑料注射器内。室温放置15min，再移至4℃放15~30min。 7.琼脂糖凝固后，从Plexiglas模具收集凝胶栓，或从Tygon管和注射器挤出凝胶。将圆柱形凝胶栓切成1cm长的段。 8.3倍体积酵母裂解缓冲液内37℃温育凝胶块3h，化学通风橱内进行。 9.干净培养皿内加入3倍体积含有0.1mg/ml蛋白酶K和1%(m/V）Sarkosyl的L缓冲液。移入凝胶块，50℃温育3h。用新鲜等体积上述缓冲液替换旧的，继续50℃温育12~16h。 10.在50倍体积含40μg/mlPMSF的TE(pH7.6)50℃温育凝胶块1h。用新鲜等体积上述溶液替换旧的，继续50℃温育1h。 11.除去含PMSF的TE,用新鲜等体积TE(pH7.6)室温继续温育1h。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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