丙二醛(MDA)的测定方法
来自 : 蚂蚁淘
DNAFromWholeBloodforPCR
(fromHiguchi,R.(1989)Amplifications2:1-3)
- Obtain65-100µlofbloodbyretro-orbitalbleedwithaheparinizedmicrocapillarytube.Expelbloodimmediatelyintoa1.5mlmicrofugetubecontaining20µlof10mMEDTA.Miximmediatelytopreventclotformation.Storeoniceuntilprocessing.
- Add200µlLysisBuffertoeachtubeandvortextosUSPendevenly.
- Microfuge25secondsat16000xgtopelletnuclei.
- Removeanddiscardsupernatantandrepeatsteps2-4twomoretimes,oruntilnohemoglobinremains.
- Resuspendnuclearpelletin100µlPBNDwith60µg/mlproteinaseKandincubateat55Cfor60minutes(orovernight,ifconvenient).
- Heatsamplesto97Cfor10minutestoinactivateproteinaseK.
- Add1-5µlofDNAsolutionfora25µlPCRreaction.
Reagents:
- 1)LysisBuffer
- 0.32MSucrose10mMTris-HCl(pH7.5)5mMMgCl21%v/vTritonX-100
- 2)PBND(PCRBufferwithNonionicDetergents)*
- 50mMKCl10mMTris-HCl(pH8.3)2.5mMMgCl20.1mg/mlgelatin0.45%(v/v)NonidetP400.45%(v/v)Tween20
AutoclavetosterilizeanddissolvegelatinStorefrozen
*AddproteinaseK(60µg/ml)immediatelypriortouse)
Typical25µlPCRreaction:
1-5µlDNA2.5µl10xPerkinElmerbuffer,1.5mMMgCl2(final)2µl2.5mMdNTPmixture(2.5mMeachdNTP,200µMfinal)0.5µl20µMforwardprimer(0.4µMfinal)0.5µl20µMreverseprimer(0.4µMfinal)0.1µlTaqDNApolymerase(candecreaseto0.05µl)dH2Oto25µl
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