| 实验方法原理 | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 制备性的DNA亲和层析树脂 试剂、试剂盒 | 缓冲液Z或其他柱缓冲液（如缓冲液Ze或TM)配制时含不同的KCl浓度（从缓冲液Z0.1molLKCl至缓冲液Z1molLKCl对缓冲液Z0.1molLKCl透析的部分纯化的蛋白质组分非特异性的竞争DNA柱再生缓冲液柱储存缓冲液 仪器、耗材 | 一次性的层析柱（Poly-prepBio-Rad)SorvallSS-34转子或相当的转子液氮硅化的细玻璃棒 实验步骤 | 1)一次性层析柱中1mL床体积的DNA亲和树脂，用10mL缓冲液Z/0.1mol/LKCl洗涤2次，进行柱平衡。 2)在缓冲液Z/0.1md/LKCl中将部分纯化的蛋白质组分与非特异性的竞争DNA(由DNA结合研究确定）结合。 3)将混合物在冰上孵育10min。 4)12000g，4℃离心10min，以沉淀不溶性的蛋白质-DNA复合物。 5)上清在重力作用下加于柱上（如对SepharoseCL-2B柱，15mL/h)。 6）加样完毕后，用缓冲液Z/0.1mol/LKCl洗柱4次，每次2mL,要淋洗柱的内侧壁。 在这一步中，分次用2mL/份洗涤缓冲液淋洗柱内侧壁，从而充分洗涤该亲和柱是十分重要的，用单独一次8mL洗达不到效果。 7)从柱子上洗脱蛋白质，依次加1mL缓冲液Z/0.2mol/L、KClZ/0.3mol/LKCl、Z/0.4mol/LKCl、Z/0.5mol/LKCl、Z/0.6mol/LKCl、Z/0.7mol/LKCl、Z/0.8mol/LKCl、Z/0.9mol/LKCl之后加1mL缓冲液Z/1mol/LKCl洗3次。与所加的1mL/份缓冲液相应，收集各1mL级分。将这些蛋白质样品在液氮中速冻，保存于-80℃。样品一般可保存至少2年。 8)用DNA结合分析法分析各蛋白质组分中序列特异性DNA结合活性。用SDS-PAGE电泳及银染观察蛋白质，估计蛋白质组分的纯度。 如果需要进一步纯化，将具有活性的组分合并，依据KCl浓度，或稀释（用不含KCl的缓冲液Z),或透析（对缓冲液Z/0.1mol/LKCl)至0.1mol/LKC1。然后将该蛋白质组分与非特异竞争性DNA合并，再用新鲜的或再生的DNA亲和介质进行分离。 如果在柱洗脱液中或流出液中都没有检测到目的蛋白，那么蛋白质可能仍留在柱子里，这就需要更高浓度的盐溶液（如2mol/L的KCl)把蛋白质洗脱下来。 9)按如下方法再生亲和介质：室温下，停止柱流洗，在柱上加5mL柱再生缓冲液。用一支硅化了的细玻棒搅拌介质，使介质与再生缓冲液混合，让缓冲液流出柱子。重复。 10)要保存柱子，则加10mL柱保存缓冲液，让其缓慢流过。重复此步洗涤，然后封闭柱的下端，再加5mL缓冲液。封闭柱的上端，置于4℃保存。 注意事项 | 其他 | |
