―、材料与设备

(一）细胞

1)HeLaS3细胞在含5%新生牛血清(NCS)和0.15%NaHCO₃的RPMI1640培养基中于37℃转瓶培养，每天进行细胞传代以维持细胞密度为每毫升2〜5X10⁵个细胞

2)TgSVA细胞来源于表达脊髓灰质炎病毒受体的转基因小鼠肾，用含5%胎牛血清和0.15%NaHCO3的DMEM培养基维持单层培养

3)Lx细胞来源于表达人脊髓灰质炎病毒受体的Ltk细胞，用含5%胎牛血清、10⁴mol/L次黄嘌呤、4×10^-3mol/L氨基嘌呤，8×10^-4mol/L胸腺嘧啶脱氧核苷和0.15%NaHCO₃的DMEM培养基维持单层培养

4)NS20Y细胞(鼠成神经细胞瘤）在含10%胎牛血清和0.15%NaHCO₃的高糖DMKM培养基中维持培养

5)人肝癌来源的HepG2细胞用含10%胎牛血清和15%NaHCO₃的DMEM培养基培养。

(二）制备S10抽提物

所用试剂和水均无RNase，耗材为一次性使用

1)lmol/LHEPES-KOH(PH7.5)，高压灭菌，室温保存

2)lmol/LTris-HCl(pH7.5),高压灭菌，室温保存

3)等渗溶液：35mmol/LHEFESKOH(pH7.5)，146mmol/LNaCl，11mmol/L葡萄糖。高压灭菌，4℃保存

4)低渗溶液：l0mmol/LHEPES-KOH(pH7.5)，15mmol/LKC1，1.5mmol/LMgAC₂，6mmol/L巯基乙醇,-20℃保存

5)10X盐溶液：200mmol/LHEPESKOH(pH7.5)，1.2mol/LKC1，50mmol/LMgAc₂,6mmol/L疏基乙醇。-20℃保存

6)裂解溶液：l0mmol/LHEPES-KOH(pH7.5)，120mmol/LKC1，1.5mmol/LMgAc₂，lmmol/L二硫苏糖醇-

7)0.2mol/L磷酸肌酸(CP):磷酸肌酸溶于无RNase的水中，按0.2〜0.3ml分装，一20°C保存

8)10mg/ml肌酸磷酸激酶(CPK):CPK溶于20mmol/LHEPES,pH7.5和50%甘油溶液中，按0.2rnl分装，一20℃保存

9)15OOOU/ml核酸酶：lml无RNase的水中溶解15000U(=0.667mg)核酸酶S1，—20℃保存

10)15mg/mltRNA:溶解ISmgtRNA在lml水中，酚抽提数次，乙醇沉淀。再用无RNase的水溶解沉淀，浓度为15mg/ml，—20℃保存

11)lmmol/L尚铁血红素：6.5mg高铁血红紊溶解在0.5ml1mol/LKOH，加0.5mLTris-HCl(pH7.5)，用lmol/LHCl调至ph7.8，加8.5ml己二醇。18000g离心5min，收集上清，一20°C保存

12)l00mmol/L亚精胺：溶解在无RNase的水中，一20℃保存。

13)0.2mol/LEGTA:溶解在无RNase的水中，用5mol/LKOH调整至PH7.5,4℃保存

14)20mmol/LATP:溶解122mgATP在10ml无RNasc的水中，用lmol/LNaOH调整至pH7.0,按0.2〜0.5ml分装于—20℃保存

15)20mmol/LGTP:溶解96mgGTP在10ml无RNase的水中，用lmol/LNaOH调整至pH7.0,按0.2〜0.5ml分装，一20℃保存

16)高速离心机。

17)Dounce匀浆器。

(二）体外转录

1)质粒DNA:包含T7或T3启动子的质粒DNA和来源于脊髓灰质炎病毒或HCV的IRES。

2)DNaseI:无RNase的DNaseI(2U/ul)。

3)LiC1沉淀溶液：7.5mol/L，LiC1，50mmol/LEDTA。

4)TE：10mmol/LTris-HCl(pH7.6),lmmol/LEDTA

(四）体外翻译

1)S10翻泽混合物；4ul0.5mol/LHEPESKOH(pH7.5),26UL15mol/LKAc，0.8ulMgAc2,50ul20mmol/LATP,2.7UL20mmol/LGTP，45ul0.2mol/LCP.2ul1mol/LDTT,2ul0.1mol/L亚精胺，11ullmmol/L氨基酸混合物(无甲硫氨酸）。加无RNase的水至I8Oul,30〜50ul分装，一80℃保存

2)[32S]Met:10mCi/ml的[32S]Met(120Ci/mmol)(翻译级），一80℃保存

3)肌酸磷酸激酶（CPK):0.5ug/ul的CPK，用10mg/mlCPK和无RNase的水新鲜配制

4)SDS凝胶电泳装置

5)10%SDS胶：9.8%丙烯酰胺，0.2%亚甲双丙烯酰胺，1%SDS，0.375mol/LTris-HCl(pH8.8)

6)电泳缓冲液：3gTris碱，14.4g甘氨酸，lgSDS，加水至1L

7)2X上样缓冲液：100mmol/：LTris-HCKpH6.8),200mmol/LDTT，4%SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油

8）凝胶固定液:50%甲醇，10%HAc溶在水中。


二、操作方法

(-）体外翻译抽提物的制备

1.未感染的HeLa细胞

除非特殊说明，所有的步骤均须在0〜4℃进行。

1)用低温离心机于300g离心7min,收集大于2L的悬浮培养液中的HeLa细胞

2)等渗溶液洗3次。此后步骤感染的与未感染的HeLa细胞一样。

3)在小体积等渗溶液中重悬细胞，并转移至一带刻度的锥形离心管中

4)于300g离心而后调整细胞密度至2X10⁹/7〜8ml，重悬细胞于1.5倍细胞体积（10ml)的低渗溶液中，(TC静置10min)

5)冰冷的Dounce匀浆器匀浆50次，显微镜下检査匀浆物屮细胞是否完全裂解。

6)加5/18体积的10X盐溶液，18000g离心弃去沉淀沉淀包含细胞核、线粒体、膜结构样细胞组分），上清即为粗制的S10抽提物

7)加入ATP至终浓度为lmmol/L,加入GTP至终浓度为0.2nnnol/L,加入CP至终浓度为8mmol/L,加入CPK至终浓度(0.2mg/ml,于37℃C温育30min,以除去核糖体上结合的内源mRNA。

8)100倍体积的裂解溶液于4°C温育lh,或者将抽提物过G-25柱以代替裂解。

9)如果S10抽提物变得浑浊，于6600g离心5min，收集乳白色上清进行以下步骤。

10)将0.2mllmmol/L高铁血红素，50ul10mg/mlCPK，0,lml0.1mol/LCaCl2,0.lml15000U/ml核酸酶S7于15〜20℃温育5〜15min,以破坏内源mRNA

11)加入0.lml0.2mol/LEGTA,40uL15mg/mltRNA将停止核酸酶反应。如果必要，于6600g离心5min，0.2〜0.3ml分装冻存于-80℃

2.脊髄灰质炎病毒感染的HeLa细胞

1)收集HeLa细胞（5L,2X10⁹个细胞），悬浮在1/20体积（250ml)的无血清RPM11640中。

2)感染脊髓灰质炎病毒，感染复数MOI为20(4Xl0¹⁰pfu）（pfu空斑形成单位）

3)室温吸收20min，然后37°C温育40min

4)加3倍体积（750ml)包含7.5%NCS的RPMI1640。在转瓶中37℃温育感染细胞4h。以下制备S10的方法同未感染病毒的Hela细胞。

3.感染和非感染的单层细胞

1)用来制备S10抽提物的单层细胞（TgSVA、Lx、NS20Y和HepG2)的生长状态应保持良好。经0.02mol/LEDTA和0.1%胰蛋白酶消化后，从60〜100个培养皿(直径150mm)中收集2X109个细胞，悬浮在含血清的DMEM培养液中在转瓶中继续培养5〜8h。

2)如果要感染脊髓灰质炎病毒，加入病毒感染复数MOI为20并在悬浮培养液中培养5h,吸收方法同HeLa细胞。

3)感染后在悬浮培养液屮继续培养4h，准备S10柚提物方法同HeLa细胞。

(二）体外RNA合成

1)合适的内切酶线性化基因，酚：氯仿纯化。DNA片段不必进行分离，通过标准的体外转朵方法制备转录子，或采用商品化试剂盒制备。

2)RNA被转录后消化模板DNA，加入1U/样品的无RNase的DNaseI于37℃温育15min

3)加入1/2体积的7.5mol/LLiCl，一20℃放置30min。

4)10000g离心10min，用80%乙醇洗RNA沉淀，风干沉淀并溶于0.5ml无RNase的TE(终浓度1ug/ul)。通常1ug模板DNA对转录5o〜100ugRNA，按10〜20ul分装并储存于-80℃

5)通过琼脂糖凝胶电泳分析RNA产物大小，分光光度计分析产量。

(三）无细胞翻译

储存于一8O℃的S10抽提物只能冻融一次，而11对于每一个抽提物和每一个mRNA，其合适的K⁺,Mg²⁺离子浓度是不同的。

1)将所冇的组分加至管中，最终反应包含20ul(或l0ul)SlO翻泽混合物和RNA模板，加无RNase的水至终体积25ul(或12.5ul)

例如，脊髓灰质炎病毒mRNA在HeLaS10屮的反应混合物：13.5ulS10,4.5ul翻译混合物，1ul0.5ug/uLCPK,0.1ulRNasin，0.5uCi[32S]Met,模板RNA(0.5ug），加无RNasin水至25ul,每个试剂的终浓度为：1.0mmol/LATP,57umol/LGTP，9mmol/L酸肌酸(CP)，0.02ug/ul肌酸磷酸激酶(CPK),2mmol/LDTT，0.2mmol/L亚精胺，20mmol/LHEPES,120mmol/L(HCVmRNA是150mmol/L)KAc,0,8mmol/L(HCVmRNA是1.5mmol/L)MgAc2，19种氨基酸每种60umol/L，0.5pCi[32S]Met和0.5ugRNA

2)于30〜32°C温育(通常为60min)，加样品缓冲液至翻译混合物，煮沸2min，10%SDS-PAGE分析。

3)如果必要，在曝光时可采用放射性自显影增感屏(autorADIographyenhancer)。