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融合蛋白的免疫筛选实验——基本方案

来自 : 蚂蚁淘

实验材料	大肠杆菌
试剂、试剂盒	LB顶层琼脂糖叠氮钠第一抗体
仪器、耗材	硝酸纤维素滤膜
实验步骤	1. 在150mlLB平板上滴定λgt11CDNA文库的滴度，宿主菌为大肠杆菌LE392菌株，每个平板使用7ml1%LB顶层琼脂。 2. 选择适当的滴度铺平板，于37℃温育8h。 3. 将直径132mm硝酸纤维素滤膜分别编号，放入上述已培养8h的平板中，于37℃温育过夜。 4. 用针头刺孔并用印度墨汁在每张滤膜上作一标记，然后取出滤膜。 5. 在室温用免疫筛选缓冲液洗膜30min，以封闭滤膜并洗去膜上的残留细菌，重复洗涤2~4次。 6. 将第一抗体（稀释于免疫筛选缓冲液中，终浓度为0.5~10μg/ml）加到装有滤膜的塑料袋中，热封口后置40℃水平摇床上反应2~24h。 7. 于4℃用免疫筛选缓冲液洗膜4~5次，毎次5~10min。 8. 接着将¹²⁵I标记的第二抗体（0.5×10⁶cpm/ml）加入装有滤膜的热封塑料袋中，4℃反应2~6h。 9. 在4℃用免疫筛选缓冲液洗膜4~5次，然后用滤纸将滤膜上的液体吸干。 10. 用塑料保鲜膜包裹好滤膜，使用增感屏在-70℃对X光片曝光。 11. 通过反复稀释，纯化λ噬菌体cDNA融合蛋白克隆，最终获得单一的阳性克隆。 12. 培养阳性克隆，制备重组λ噬菌体DNA。