基因枪法转化大麦实验 实验方法
| 实验材料 | 麦穗 试剂、试剂盒 | 植物凝胶乙醇次氯酸钠蒸馏水亚精胺 仪器、耗材 | EP管移液枪 实验步骤 | 1.组织培养基的准备 (1)首先准备所需浓度2倍的植物凝胶，高压灭菌（见注2)。 (2) 所有的组织培养基都要过滤灭菌，因此除了无菌的储备液，其他培养基成分按所需浓度2倍的量混匀，调到合适的pH后过滤灭菌（使用瓶顶过滤器、0.22μm微孔滤膜）。 (3)使用前将2x凝胶和2x培养基在水浴锅中加热至60℃。 (4)将所需储备液在无菌条件下加入到热的培养基中，培养基和植物凝胶混合后倒入9cm培养皿中（Sterilin)。 (5)分化培养时，使用高培养皿（100mmx20mm，Falcon)。 (6)渗透处理时，使用5cm小培养皿（Sterilin)。 2.幼胚的分离 (1)幼穗的采收与消毒 ①当幼胚直径长到1~2mm时米收麦穗（见注3)。 ②在取麦穗之前，从每一穗中间取一粒种子，查看幼胚的大小，确保达到所需的要求[可参考第9章「农杆菌介导的大麦转化方法」，图9.2(a)~（c)]。 ③将种子从穗子上取下来，去芒，但不要破坏种壳。 ④先用70%的乙醇冲洗30s，再用蒸馏水冲洗3遍，然后在次氯酸钠（Fluka71696)与水比例为50：50的溶液中浸泡4min，再用蒸馏水冲洗4遍，最后将水倒掉但保持种子湿润，置于无菌的螺口瓶中待用。 (2)分离幼胚摘除胚轴 所有的操作均在超净台中进行： ①每次大约取20粒无菌种子，置于解剖镜无菌的蓝色或黑色底板上，用一只镊子固定种子，另一只慑子剥出幼胚，去除胚轴（见注4)。 (2)每皿愈伤诱导培养基放25~30枚幼胚，盾片朝上，25℃暗培养。 3.制备DNA包裹的金粉微粒 (1)制备金粉母液 DNA包裹金粉微粒的方法与文献[9]中的方法相似 ①称40mg金粉于1.5mlEP管中，加入1ml100%乙醇。 ②涡旋振荡使金粉充分混匀，离心使其沉淀。 ③倒掉乙醇，重复步骤2两次。 ④最后一次离心后，去除乙醇，加入1ml无菌水涡旋振荡使之重悬。 ⑤将金粉以50μl分装于无菌的EP管中，分装时注意不断混合以保持金粉颗粒处于悬浮状态，分装后保存在-20°C。 (2)亚精胺制备 ①将装有1g亚精胺（Sigma-Aldrich)的瓶子置于65°C水浴锅中加热使之融化。 ②用移液枪取14μl溶液分装于无菌的1.5ml离心管中，-20℃储存待用。 (3)金粉微粒的包裹 ①从冰箱中取出亚精胺，并使其解冻。 ②加入986μl无菌水，涡旋振荡混合。 ③用1ml过滤器和小的过滤器滤头（Minisart0.2μm过滤器，Sartorius)将溶液过滤到无菌的1.5ml离心管中，制成0.1mol/L亚精胺溶液。 ④从冰箱中取出一管50μl的金粉并使之解冻。 ⑤沿装有金粉的离心管管壁，加入5μlDNA(1μg/μl)，立即涡旋振荡使金粉和DNA充分混合（见注5)。 ⑥然后将50μl 2.5mol/LCaCl2和20μl0.1mol/L亚精胺加入到离心管管盖中，盖好盖子，颠倒离心管使CaCl2和亚精胺与金粉颗粒混合（颠倒离心管之前不能让CaCl2和亚精胺与金粉颗粒混合），立刻涡旋振荡使所有组分充分混合。 ⑦管子在冰上放置1min，然后于1957g离心不超过30s，使金粉沉淀。 ⑧去除上清液，加入250μl100%乙醇，用枪头轻轻吹打混匀，然后涡旋振荡，这个过程是洗涤包埋了DNA的金粉微粒。 ⑨1957g离心不超过30s沉淀金粉微粒，去除上清，加入60μl100%乙醇。 ⑩涡旋振荡重悬金粉颗粒。DNA包埋的金粉微粒即微载体已制备完毕。 4.粒子轰击幼胚 (1)幼胚渗透处理 轰击前，取分离1天后的幼胚，放在高渗培养基中处理4h。每皿20~30枚幼胚，置于培养皿中心1.6cm2范围内，盾片朝上。胚可以放得紧密一些，但相互之间不要碰到。轰击之后幼胚继续高渗处理16h。 (2)基因枪准备 ①基因枪所有组件和内部的枪体都要用100%乙醇清洗消毒。终止屏和载体膜浸泡在乙醇中消毒，然后晾干。破裂盘在用之前浸泡在异丙醇中，无需再消毒。 ②载体膜晾干后，先放入载体膜支架，然后吸取3.5μl包裹了DNA的金粉微粒点到每张载体膜中央。吸取金粉微粒时注意保持悬浮状态。 (3)基因枪参数 基因枪的各个组件在轰击室的位置如下： 破裂盘和载体膜之间的距离：2.2cm 载体膜和终止屏之间的距离：1.3cm 终止屏和样品架之间的距离：5.8cm (枪体基部往上第三挡） 真空度：28in.Hg. (4)粒子轰击 ①在轰击幼胚之前，基因枪先空轰击两次（见注6)。 ②将1100psi的破裂盘在异丙醇中浸泡后放置在破裂盘固定帽内，然后将固定帽连接到基因枪腔体内的氮气气体加速管，基部旋紧。 ③将终止屏放入微载体发射组件中，然后把点有金粉微粒并已干燥的载体膜放入载体膜支架，安装在固定槽中（载体膜有金粉微粒的一面朝下），旋上盖子，将微载体发射组件放在破裂盘固定帽下面的位置上。 ④把放有幼胚的培养皿放在样品架上，样品架置于从轰击室底往上数的第三挡上，拿走培养皿盖，关上轰击室门，抽真空使真空度达到28in.Hg后保持，然后轰击。 ⑤当真空释放后，打开轰击室门，放回培养皿盖，准备下一次轰击。 ⑥轰击后的幼胚在25°C暗培养。 5.转化子筛选 (1)轰击后16h，将幼胚从高渗培养基转移到含有5mg/L双丙氨膦的愈伤组织诱导培养基中进行选择，25℃暗培养。 (2)每隔两周更换一次含有5mg/L双丙氨膦的愈伤组织诱导培养基。 (3)选择培养4周后，即第二次更换培养基时，将来源于同一个幼胚的愈伤组织分成3~6个小块，并做好标记，保证来源于同一个幼胚的所有愈伤组织在一起。 (4)选择培养6周后，即第三次更换培养基时，将剩余健康的愈伤组织转移到含有1mg/L双丙氨膦的过渡培养基中，在25℃弱光下培养，即把培养皿放到有光照的组织培养室中，在每个培养皿上盖一张薄纸片。 6.转基因植株再生 (1)在过渡培养基上培养两周后，将来源于同一个幼胚的组织转移到再生培养基上（图8.2)。用深度大的培养皿，培养基不加任何生长调节剂，只含有1mg/L双丙氨膦。每2周用同样的培养基进行继代，直到不再有新的再生苗长出。 (2)当幼苗的芽长到2~3cm，也形成根时，从培养皿中移出转移到含有12ml愈伤诱导培养基的玻璃试管（SigmaC-5916)中。培养基不加任何生长调节剂，只含有1mg/L的双丙氨膦。 (3)当长根的幼苗长到试管顶部，就可以转移到土壤中。用长镊子轻轻地将幼苗从试管中移出，根部的组织培养基用水冲洗干净。 (4)将幼苗用同样的大麦生长介质种在直径为5cm的盆中，幼苗上面盖一个有孔的塑料杯以保持湿度，直到幼苗在土壤中定植良好。 (5)当幼苗在土壤中扎根后，就可以采集叶片分析目的基因是否存在。双丙氨膦选择不像潮霉素选择那样（详见第9章「农杆菌介导的大麦转化方法」），一些非转化的植株也可能存活。 (6)快速简易的检测再生植株转化状态的方法是用叶片进行除草剂抗性测试[8]。  7.用基因枪进行瞬时检测 基因枪轰击的一个重要用途是进行瞬时分析，常用于稳定转化前对载体的检测。在瞬时分析时，装有幼胚的培养皿一般轰击两次以提高DNA的转化量，建议在两次轰击间以90°角转动培养皿（见注7)。图8.3(a)和图8.3(b)分别是用含有葡萄糖苷酸酶基因(gus)和绿色突光蛋白基因（gfp）的金粉微粒轰击幼胚后进行瞬时表达的两个示例。  |
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发布于 ： 2018-08-06
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