| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | CDNA 试剂、试剂盒 | Ready-To-GoDNA标记试剂盒人肝脏λgt11cDNA文库人肝脏λgt10cDNA文库杂交溶液SSC溶液pBluescriptIISK载体 仪器、耗材 | PCR扩增仪 实验步骤 | 实验所需「试剂」具体见「其他」 1.杂交反应 抽提出的50bp的PCR产物用PCRII载体亚克隆，大量制备，用限制性消化酶EcoRI将50bp的插入片段切下，用[α-32P]dCTP标记已克隆的50bpDNA，并作为探针筛选人肝脏λgt11cDNA文库，获得11个阳性克隆，测定最长的阳性克隆λPK5序列，这个克隆（1.7kb）编码的PK-120的碳末端，为了获得编码PK-120其余部分的克隆，用[32PdCTP]标记的λPK5插入片段作为探针筛选人肝脏λgt10cDNA文库，在杂交液中60℃预杂交，65℃杂交过夜，然后在60℃用0.1％SDS的2×SSC溶液30min洗4次，洗净。将阳性克隆的插入片段进一步亚克隆，插入BluescriptIISK-vector载体，获得106个阳性克隆，测定阳性克隆λPK67（3.0kb）序列，λPK67编码PK-120的非5"端密码子区域及PK-120氮末端，并含有信号肽序列。 2.cDNA推测PK-120一级结构的特征 PK-120的核苷酸序列据此推导的氨基酸序列见图。PK-120的cDNA。编码区为开放阅读框，有2790bp，以密码ATG为起始，以密码TAG为结尾，从而推测出PK-120蛋白质氨基酸序列。它含有28个氨基酸组成的信号肽，成熟蛋白有902个氨基酸组成，20％序列为蛋白质测序所证明。有四个N-糖基化部位，有三个半胱氨酸残疾，这和PK-120的氨基酸组成测定结果一致。Cys719和Cys892在35kDa片段内形成二硫键，Cys186以游离状态存在。PK的酶切位点附近的序列是-Phe-Arg-Xaa-Arg455，Arg633和Arg660是PK的切断部分。 据同源性分析表明：PK-120氨基酸序列和人胰蛋白酶抑制剂（inter-α-trypsininhibitor，ITI）超家族的重链HCs有关，和HC1，HC2分别具有34％，31％的同源性，和人前α胰蛋白酶抑制剂HC3有38％的同源性。已有的研究表明，PK-120和ITI一样，是一种主要急性相蛋白，这为研究炎症产生的复杂过程打开了新的大门。 注意事项 | 其他 | 试剂： Ready－To－GoDNA标记试剂盒 人肝脏λgt11cDNA文库 人肝脏λgt10cDNA文库 杂交溶液：7％（w/v）聚乙二醇6000，10％SDS，100ug/ml酵母tRNA SSC溶液：15mmol/L枸橼酸钠，15mmol/LNaCl，pH7.0 pBluescriptIISK载体 |
