Rabbit Primary Spleen Endothelial Cells_Cell Biologics_
| 实验方法原理 | 小量BACDNA是从5mlBAC转化细胞培养物中制备的。DNA的制备采用碱裂解法。BACDNA的产量可达0.1~0.4 μg，足够用于限制酶切分析、PCR或Southern印迹。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 限制性内切核酸酶大肠杆菌 试剂、试剂盒 | 乙醇异丙醇DNA提取液碱性裂解液STE溶液TE 仪器、耗材 | 脉冲场凝胶电泳仪LB培养基DNA标准参照物SorvallSS-34转头或同类产品层析树脂 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 乙醇 异丙醇 DNA提取液 碱性裂解液Ⅰ，预冷 碱性裂解液Ⅱ 碱性裂解液Ⅲ，预冷 STE溶液，预冷 TE(pH8.0) 2.酶和缓冲液 限制性内切核酸酶 3.凝胶 脉冲场凝胶电泳仪 4.培养基 含12.5μg/ml氯霉素的LB培养基 5.核苷酸与寡核苷酸 脉冲场凝胶电泳所需的DNA标准参照物 6.离心机与转头 SorvallSS-34转头或同类产品 7.专用设备 层析树脂 8.载体和菌株 BAC转化的大肠杆菌 二、方法 1.用5ml含12.5μg/ml氯霉素的LB培养基培养BAC转化的大肠杆菌，37℃剧烈振摇过夜。 2.4℃下，2000g(用SorvallSS-34转头，4100r/min)离心5min,收集细菌。小心弃去培养液，用吸头吸净残液。 3.在每个离心管中加5ml预冷的STE，用移液器吹悬细菌沉淀。按步骤2离心收集细菌。 4.将细胞重悬于200μl冰冷的碱性裂解液Ⅰ中。将细胞转移至预冷的微量离心管中，置于冰上。 5.向管中加入400μl新鲜配制的碱性裂解液Ⅱ。轻轻将盖紧的离心管翻转数次。将离心管置于冰上。 6.向管中加入300μl冰冷的碱性裂解液Ⅲ，轻轻将盖紧的离心管翻转数次。将离心管置于冰上5min。 7.在微量离心机上以最大速度4℃离心5min，除去细胞碎片沉淀。将上清移入一新的微量离心管中。室温下加入900μl异丙醇，轻轻翻转数次离心管，混匀。 8.立即在微量离心机上室温下以最大速度离心5min，使核酸沉淀。弃去上清，用1ml70%乙醇小心漂洗沉淀。室温下离心2min，吸去乙醇。在室温下干燥沉淀5~10min。将湿沉淀溶于50μlTE(pH8.0)中。 9.用限制性内切核酸酶消化BACDNA。 10.用PFGE分析消化的BACDNA。电泳要采用大小适合的DNA标准参照物。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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