| 实验方法原理 | 外周血是制备动物染色体标本的重要材料之一,但通常情况下哺乳动物的外周血中是没有分裂相的,其他动物如两栖类外周血中也只是偶尔能见到分裂相。外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期,在人工离体培养的培养基中加入植物凝集素(photohemagglutinin,PHA)后,小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞,随后进入分裂期。这样,经过短期培养后,用秋水仙素处理,就可获得大量有丝分裂中期细胞,以用于制备染色体标本。 | ||||||||||
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| 实验材料 | 人外周血淋巴细胞 试剂、试剂盒 | RPMI“1640”培养基小牛血清肝素生理盐水溶液(500单位ml)5%NaHCO3秋水仙素(4μgml)PHA双抗(青霉素1万单位ml、链霉素1万单位ml) 仪器、耗材 | 超净工作台恒温培养箱恒温水浴锅离心机20ml培养瓶注射器及针头剪刀及镊子烧杯及量筒 实验步骤 | 1.培养基的分装:在超净工作台内,用量筒取“1640”培养液40ml、血清10ml,用1ml注射器取肝素0.3ml、PHA0.4ml、双抗0.3ml(终浓度各140单位/ml)。混匀后,用5%NaHCO3调整pH值至7.2。用5ml移液管分装入20ml培养瓶,每小瓶5ml,盖紧皮塞,胶布封口备用。如不立即使用可置0℃保藏,用前用37℃水浴处理10min即可。 2.采血:用肥皂洗净供血者的手,再用2%碘酒、75%酒精擦拭指尖消毒,待酒精完全挥发干之后,用无菌采血针或三棱针刺破指尖,用无菌吸管吸0.3～0.4ml血液移入培养瓶,轻轻摇动,使血与培养基混匀即可培养(或用2ml注射器,7号针头,先吸取少许肝素溶液润湿针筒,从肘静脉采血1～2ml,每个培养瓶接种全血0.3ml左右)。 3.培养:将接好血细胞的培养瓶置37℃温箱中培养68～72h。 4.秋水仙素处理:培养终止前6～10h加秋水仙素(2μg/ml),用5号针头加3～4滴,使最终浓度为0.01～0.02g/ml,处理2～4h。 5.低渗处理:由温箱中取出培养瓶,用吸管吸去上清液,培养物沉积在瓶底,加入约6.5ml经37℃预热的0.075mol/LKCl溶液吹打均匀,置37℃水浴中低渗处理20min,使红细胞破碎,白细胞膨胀。 6.离心:以1000r/min离心5min,用吸管吸去全部上清液及沉淀上层较透明的部分(红细胞碎片),收集白细胞。 7.固定:沿管壁慢慢加入甲醇-冰醋酸(3∶1)固定液5～6ml,吸管吹打均匀,固定20min。1000r/min离心5min,弃上清液。 8.制片:视离心管底细胞多少加入少量新鲜固定液,吹打成均匀悬浮液。取洁净冰水中预冷的载玻片,稍作倾斜,用吸管吸取一滴上述细胞悬浮液,于载玻片上方适当高度滴在载玻片上,立即吹散吹匀载玻片上细胞,空气干燥(所得制片可留作显带实验)。 9.染色:载玻片充分干燥后,用pH6.8的磷酸缓冲液按1份Giemsa原液、9份磷酸缓冲液混匀后染色。材料面向上,用染液覆盖载玻片,染色10～15min,用流水洗去多余染液,再用洗水纸吸干多余水分,干燥后即可镜检。 在低倍和中倍镜下,寻找分散适宜,染色体不重叠,浓缩程度适中,形态清晰的分裂相,并在油镜下观察染色体的数目和形态。选择一有代表性分裂相,用数码成像系统进行显微摄影,以供作核型分析之用。 注意事项 | 1.接种的血样越新鲜越好,最好是在采血后24h内进行培养。如不能立即培养,应置于4℃存放,避免保存时间过久,影响细胞活力。 2.在培养中成败的关键点除了PHA的效价很重要外,培养温度和培养液的酸碱度也十分重要。人外周血淋巴细胞培养最适温度为37±0.5℃,最适pH值为7.2～7.4。 3.在培养过程中,如发现血样凝集,可将培养瓶轻轻振荡,使凝块散开,然后再放回37℃培养。 4.本实验采用人外周血微量培养法进行人染色体制片,其他动物可采用相同的方法,只是根据不同对象进行适当的改动。 5.如果细胞膨胀得不够大,细胞膜没有破裂,或者染色体不够分散,可适当延长低渗时间。 其他 | |
